检测响叶杨基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方法

检测响叶杨基因组的pcr特异性引物以及pcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及检测杨树种类的引物以及检测方法，尤其涉及检测响叶杨(populus adenopoda maxim.)基因组的pcr特异性引物以及pcr检测方法，属于响叶杨基因组的pcr检测领域。


背景技术：

2.目前针对不同树种鉴定的引物主要以ssr为主，但ssr引物存在于所有物种中，基因组水平不够特异，迄今为止，缺少仅针对响叶杨的基因组特异的鉴定引物，这种特异引物可以快速鉴定出某一树种中是否有响叶杨的基因组成分，从而可以推断响叶杨是否参与了该树种的形成。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一是提供准确鉴别响叶杨基因组的特异性pcr引物对；
4.本发明的目的之二是提供一种快速区分响叶杨与其他杨属树种的pcr检测方法；
5.本发明的目的之三是提供一种检测响叶杨基因组的pcr检测试剂盒。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
7.本发明的一方面是提供了将响叶杨与其它其他杨属树种基因组相区分的特异性pcr引物对，选自引物对1或引物2中的任何一对；所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为：catgaaatttttagctgcgaga，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为：tgcatagatccagttaagagttga；
8.所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为：taaaagcaacgagagtgacacc，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为：ccatgcaccataatatcaaaca。
9.本发明的第二方面是提供了一种区分响叶杨与其他杨属树种的pcr检测方法，包括：
10.(1)提取待检测的杨树样品dna；
11.(2)以提取的杨树样品dna为模板，以引物对1或引物对2的上游引物和下游引物为pcr扩增引物对建立pcr反应体系进行pcr扩增；
12.(3)如果出现了特异性的扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因组成分；其中，以引物对1的上游引物和下游引物为pcr扩增引物建立pcr反应体系进行pcr扩增，如果出现了500bp的特异性扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因组成分；以引物对2的上游引物和下游引物为pcr扩增引物对建立pcr反应体系进行pcr扩增，如果出现了594bp的特异性扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因组成分。
13.作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所建立的pcr反应体系包括：待检测的样品dna 2μl，pcr mix 10μl，seq id no.3所示的上游引物0.5μl，seq id no.4所示的下游引物0.5μl，双蒸水7μl。
14.作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的pcr扩增的程序包括：
95℃5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，12℃,∞。
15.本发明的第三方面是提供了一种检测响叶杨基因组的pcr检测试剂盒，包括：taq酶，dntp，mg
2+
，ddh2o和pcr扩增引物；其中，所述的pcr扩增引物对选自引物对1或引物2中的任何一对。
16.本发明提供的鉴别响叶杨基因组的特异性pcr引物对可以快速区分响叶杨与其他杨属树种，采用pcr检测方法扩增及琼脂糖凝胶电泳操作方便，带型简单，不需要测序直接通过扩增片段即可区分出响叶杨特异基因组片段，有效节省人力物力，在杨树种植资源分类、利用及杂交种的鉴定方面具有很好的应用前景。
附图说明
17.图1筛选出的响叶杨基因组特异引物pcr扩增的特异条带电泳结果；1-5分别为银白杨、新疆杨、响叶杨、山杨和水(阴性对照)。
18.图2响叶杨基因组特异引物筛选过程中部分非特异性引物pcr扩增的结果；1-5分别为银白杨、新疆杨、响叶杨、山杨和水(阴性对照)。
具体实施方式
19.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
20.试验例1鉴定响叶杨基因组的特异pcr引物的筛选
21.1、试验材料
22.银白杨(populus alba l.)、新疆杨(populus alba var.pyramidalis bge.)、响叶杨(populus adenopoda maxim.)、山杨(populus davidiana dode)的基因组dna和水(阴性对照)。基于本实验室前期获得的四种杨树的基因组，通过全基因组序列比对分析，发现基因组中具有较大差异的片段并据此设计每种杨树特异引物，每条染色体设计100对引物(表1仅列举了部分的所设计的引物的核苷酸序列)，然后通过pcr扩增进行引物的筛选，选出在响叶杨基因组中的特异扩增的引物。
23.表1列出了部分的采用同样设计原理和方法所设计的区分响叶杨基因组的扩增引物。
24.表1用于响叶杨基因组特异片段扩增筛选的pcr引物
[0025][0026]
2、试验方法
[0027]
利用上述筛选出的引物组，对上述4种基因组做pcr扩增。
[0028]
pcr反应体系(20μl)：dna 2μl(10-30ng/μl)，pcr mix 10μl(sangon biotech,shanghai)，上游引物0.5μl(10μm)，下游引物0.5μl(10μm)，纯水7μl。
[0029]
pcr反应程序：95℃5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，12℃,∞。产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据条带结果，选出在响叶杨基因组存在特异条带的引物。
[0030]
3、试验结果
[0031]
表1所设计的特异性引物的扩增结果见图1和图2，区分标准为条带的有无，如在3号泳道出现条带则为检测出响叶杨基因组成分。
[0032]
由图1的扩增结果可见，chr17d-1和chr13d-1能够特异性扩增出单一的响叶杨基因组条带，其中，chr17d-1扩增效果更佳，灵敏度更高，结果更容易区分。
[0033]
根据图2可以看出，表1中的16对引物不具有响叶杨基因组的特异性，可同时扩增出其它杨树的相应片段，表明所筛选的获得的两对能够特异性扩增响叶杨的引物(chr17d-1和chr13d-1)筛选难度高，工作量大，得之不易。


技术特征：
1.将响叶杨(populus adenopoda maxim.)与其它杨属树种基因组相区分的特异性pcr引物对，其特征在于，选自引物对1或引物2中的任何一对；所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为：catgaaatttttagctgcgaga，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为：tgcatagatccagttaagagttga；所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为：taaaagcaacgagagtgacacc，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为：ccatgcaccataatatcaaaca。2.根据权利要求1所述的特异性pcr引物对，其特征在于，所述的其它杨属树种包括银白杨(populus alba l.)、新疆杨(populus alba var.pyramidalis bge)和山杨(populus davidiana dode)。3.权利要求1所述的特异性pcr引物对在检测响叶杨基因组中的应用。4.一种将响叶杨(populus adenopoda maxim.)与其他杨属树种相区分的pcr检测方法，其特征在于，包括：(1)提取待检测的杨树样品dna；(2)以提取的杨树样品dna为模板，以权利要求1的引物对1或引物对2的上游引物和下游引物为pcr扩增引物对建立pcr反应体系进行pcr扩增；如果出现了特异性扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因组成分；所述的其它杨属树种包括银白杨(populus alba l.)、新疆杨(populus alba var.pyramidalis bge.)、山杨(populus davidiana dode)。5.根据权利要求4所述的pcr检测方法，其特征在于，以权利要求1的引物对1的上游引物和下游引物为pcr扩增引物建立pcr反应体系进行pcr扩增，如果出现了500bp的特异性扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因组成分；以权利要求1的引物对2的上游引物和下游引物为pcr扩增引物对建立pcr反应体系进行pcr扩增，如果出现了594bp的特异性扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因组成分。6.根据权利要求4所述的pcr检测方法，其特征在于，步骤(2)中所建立的pcr反应体系包括：待检测的样品dna 2μl，pcr mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，双蒸水7μl。7.根据权利要求4所述的pcr检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的pcr扩增的程序包括：95℃5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，12℃,∞。8.根据权利要求4所述的pcr检测方法，其特征在于，所述的其它杨属树种包括银白杨(populus alba l.)、新疆杨(populus alba var.pyramidalis bge.)、山杨(populus davidiana dode)。9.一种检测响叶杨基因组的pcr检测试剂盒，包括：taq酶，dntp，mg
2+
，ddh2o和pcr扩增引物对；其特征在于，所述pcr扩增引物对选自引物对1或引物2中的任何一对；所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为：catgaaatttttagctgcgaga，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为：tgcatagatccagttaagagttga；所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为：taaaagcaacgagagtgacacc，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为：ccatgcaccataatatcaaaca。10.权利要求9所述的pcr检测试剂盒在检测响叶杨基因组中的应用。

技术总结
本发明公开了检测响叶杨基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方法。本发明基于银白杨、新疆杨、响叶杨和山杨的基因组，通过全基因组序列比对分析发现基因组中具有较大差异的片段并据此设计每种杨树特异引物，最终筛选出能够将响叶杨基因组与其它杨树基因组准确区分的特异性引物。本发明进一步提供了应用该特异性引物建立快速区分响叶杨与其他杨属树种的PCR检测方法以及PCR检测试剂盒。本发明可以快速区分响叶杨与其他杨属树种，操作方便，带型简单，不需要测序直接通过扩增片段即可区分出响叶杨特异基因组片段，在杨树种植资源分类、利用及杂交种的鉴定方面具有应用前景。用及杂交种的鉴定方面具有应用前景。用及杂交种的鉴定方面具有应用前景。


技术研发人员：安新民 薛胤轩 陈婷婷 吴茹茜 李影 齐婉芯 鲁海琳 郭斌
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2022.08.04
技术公布日：2022/9/15