新疆紫草3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢酶及编码基因与应用

本发明涉及药用植物基因工程领域，具体涉及新疆紫草3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢酶及编码基因与应用。

背景技术：

1、传统中药材紫草味甘、咸，性寒，归心、肝经，《本草纲目》曰：紫草“治斑疹、痘毒，活血凉血、利大肠”。2020版《中华人民共和国药典》收录的紫草主要来源为紫草科软紫草属新疆紫草[arnebia euchroma(royle)johnst.]和内蒙紫草(arnebia euchroma bunge)的干燥根，其中新疆紫草有效成分含量高，临床疗效好，是紫草的道地药材。

2、苯并呋喃类化合物是紫草的重要活性成分，该类化合物生物合成的关键步骤为中间体(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚[(z)-3″-oh-ghq]经异构化形成(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚[(e)-3″-oh-ghq]，后者再经过氧化反应形成(e)-3″-酮基-香叶基对苯二酚[(e)-3″-oxo-ghq]。后续反应中，(e)-3″-酮基-香叶基对苯二酚在酶促或自发条件下即可环化形成苯并呋喃类化合物(图1)。目前，催化中间体(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚异构化及氧化形成(e)-3″-酮基-香叶基对苯二酚的酶尚未被克隆鉴定。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供hgd蛋白及编码基因，以及其作为(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢酶的应用。

2、本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质为如下(a1)-(a4)中任一所示：

3、(a1)氨基酸序列如序列2所示的蛋白质；

4、(a2)将(a1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

5、(a3)与(a1)或(a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

6、(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

7、所述蛋白质来源于新疆紫草，具有3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢酶的功能。

8、本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料，为下述b1)至b4)中的任一种：

9、b1)编码所述蛋白质的核酸分子；

10、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

11、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

12、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。

13、其中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因：

14、b1)编码序列是序列表中序列1的核苷酸的cdna分子或dna分子；

15、b2)核苷酸是序列表中序列1的的cdna分子或dna分子。

16、所述的蛋白质或所述的生物材料在如下p1-p6中的应用也应在本发明的保护范围之内：

17、p1)所述的蛋白质或所述的生物材料在制备具有(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚异构酶活性的产品中的应用；

18、p2)所述的蛋白质或所述的生物材料在制备(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚异构酶中的应用；

19、p3)所述的蛋白质或所述的生物材料在制备具有-3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢酶活性的产品中的应用；

20、p4)所述的蛋白质或所述的生物材料在制备3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢酶中的应用；

21、p5)所述的蛋白质或所述的生物材料在制备(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚中的应用；

22、p6)所述的蛋白质或所述的生物材料在制备(e)-3″-酮基-香叶基对苯二酚中的应用。

23、其中，所述p5)中，制备(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚的底物为(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚。

24、其中，所述p6)中，制备(e)-3″-酮基-香叶基对苯二酚的底物为(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚或(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚。

25、本发明还提供一种制备(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚的方法，包括使用所述的蛋白质做为异构酶，以(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚为底物，进行酶促反应的步骤。

26、本发明还提供一种制备(e)-3″-酮基-香叶基对苯二酚的方法，包括使用权利要求1所述的蛋白质做为脱氢酶，以(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚或(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚为底物，以nad+或nadp+作为辅酶，进行酶促反应的步骤。

27、实验证明，本发明(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢酶hgd具有脱氢酶的特征结构域，酶促反应分析发现hgd可在体外催化(z)-3″-羟基-香叶基对苯二酚与(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚的相互转化，并可以催化(e)-3″-羟基-香叶基对苯二酚脱氢形成(e)-3″-酮基-香叶基对苯二酚。本发明，对于生产紫草特征性苯并呋喃类活性成分及其中间体具有重要的理论及实际意义。

技术特征：

1.一种蛋白质，所述蛋白质为如下(a1)-(a4)中任一所示：

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述b1)至b4)中的任一种：

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因：

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在如下p1-p6中的应用：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述p5)中，制备(e)-3”-羟基-香叶基对苯二酚的底物为(z)-3”-羟基-香叶基对苯二酚。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述p6)中，制备(e)-3”-酮基-香叶基对苯二酚的底物为(z)-3”-羟基-香叶基对苯二酚或(e)-3”-羟基-香叶基对苯二酚。

7.一种制备(e)-3”-羟基-香叶基对苯二酚的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的蛋白质做为异构酶，以(z)-3”-羟基-香叶基对苯二酚为底物，进行酶促反应的步骤。

8.一种制备(e)-3”-酮基-香叶基对苯二酚的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的蛋白质做为脱氢酶，以(z)-3”-羟基-香叶基对苯二酚或(e)-3”-羟基-香叶基对苯二酚为底物，以nad+或nadp+作为辅酶，进行酶促反应的步骤。

技术总结
本发明公开了新疆紫草3”‑羟基‑香叶基对苯二酚脱氢酶及编码基因与应用。本发明提供了来自于新疆紫草的(Z)‑3”‑羟基‑香叶基对苯二酚脱氢酶，为序列2所示HGD。酶促反应发现HGD可在体外催化(Z)‑3”‑羟基‑香叶基对苯二酚与(E)‑3”‑羟基‑香叶基对苯二酚互相转化，还可以催化(E)‑3”‑羟基‑香叶基对苯二酚脱氢形成(E)‑3”‑酮基‑香叶基对苯二酚。本发明对于生产新疆紫草苯并呋喃类活性成分及其中间体具有重要理论及实际意义。

技术研发人员：黄璐琦,王瑞杉,郭兰萍,王升,康传志,吕朝耕,刘长征
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25