重组己糖激酶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生化检测领域，特别涉及重组己糖激酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、己糖激酶(hexokinase，hk)，一种进化上保守的酶，可以磷酸化六碳糖(己糖)。磷酸化葡萄糖(葡萄糖-6-磷酸)在糖酵解、糖生成、磷酸戊糖和己糖胺的生物合成途径中代谢，在atp合成、nadh合成和蛋白质糖基化中发挥关键作用，是葡萄糖代谢第一步的限速酶。在细菌中，己糖激酶的分子量在32-37kda。在脊椎动物中，己糖激酶共有四种不同的亚型，分别为hk1、hk2、hk3、hk4，其中hk1-3的分子量为100kda，hk4为50kda。hk1普遍存在大多数组织中，hk2比hk1表达较少，在心脏、骨骼肌和脂肪组织以及肿瘤细胞中广泛存在。己糖激酶和葡萄糖代谢密切相关，将葡萄糖从稳定状态转变成活性状态，可以为肿瘤细胞提供能量以及物质合成必须的碳源，因此己糖激酶一直是治疗癌细胞重要的潜在靶点。在临床诊断上，它也是检测血糖含量的重要工具酶，在临床诊断试剂中具有十分重要的应用。

2、目前工业化的己糖激酶大多都来源于原始菌株发酵，或着动植物细胞培养，该种生产方式工艺不稳定，造成酶的品质参差不齐，而且不利于纯化，工艺繁琐。己糖激酶国外的竞争产品处于垄断地位，价格昂贵，因此生产物美价廉的国产酶势在必行。基因工程技术将重组dna用工具酶进行剪切，并按照认为意愿进行组合，转入为生物体进行无性繁殖，最终获得希望生产的蛋白质。这种方法效率高，适宜批量生产。因此，开发基于基因工程的稳定的己糖激酶制备方法十分重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种产量大的、产物活性好的重组己糖激酶的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供一种编码己糖激酶的多核苷酸序列。

3、本发明的另一目的在于提供与编码己糖激酶的多核苷酸序列适配的载体。

4、本发明的另一目的在于提供含有编码己糖激酶的多核苷酸序列的试剂盒。

5、为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码己糖激酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

6、(i)具有如seq id no.1或seq id no:3所示序列的多核苷酸；

7、(ii)具有与如seq id no.1或seq id no:3所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

8、(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

9、本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。

10、在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达his×6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的3’端连接有表达his×6标签的多核苷酸序列。

11、在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pet-28a(+)。

12、本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

13、所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。

14、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。

15、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)菌株。

16、本发明第四方面提供了一种制备己糖激酶的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

17、分离所述目的蛋白，即得所述己糖激酶；

18、其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如seq id no:2所示的氨基酸序列。

19、在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。

20、在一些优选的方案中，用tb培养基培养所述的宿主细胞。

21、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养的温度为36至38℃或16至20℃，更优选为17至19℃。

22、在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。

23、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。

24、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用iptg进行诱导，以表达出目的蛋白。

25、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至od600在0.6至0.8，后使用iptg进行诱导，以表达出目的蛋白。

26、在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：

27、将经破碎的目的蛋白上清液通过层析柱，进行洗脱，收集洗脱液。

28、在一些优选的方案中，所述层析柱为ni-柱亲和层析柱，例如histraptmff。

29、本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的多核苷酸；或者

30、如本发明第二方面提供的表达载体；或者

31、如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者

32、或者根据本发明第四方面所述的方法制备的己糖激酶。

33、本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

34、(1)本发明提供了经同义密码子偏好性优化的编码己糖激酶的多核苷酸序列，该序列在大肠杆菌中表达效率高；

35、(2)本发明还提供了适配上述多核苷酸序列的载体，通过载体和多核苷酸序列的协同配合，制备获得高活性己糖激酶，比活力高达111.8u/mg；

36、(3)本发明提供了制备重组己糖激酶的方法，该方法不仅提高了己糖激酶的产量，而且所得产物可溶性蛋白含量极高，易于纯化，简化了后处理步骤。

37、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

技术特征：

1.一种编码己糖激酶的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达his×6标签的多核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为ps28a(+)。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者

6.一种制备己糖激酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述的宿主细胞时，培养的温度为36至38℃或16至20℃，更优选为17至19℃。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，通过iptg诱导以表达出目的蛋白。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者

技术总结
本申请公开了一种重组己糖激酶及其制备方法和应用。本申请中提供了经同义密码子偏好性优化的编码己糖激酶的多核苷酸序列，该序列在大肠杆菌中表达效率高；还提供了适配上述多核苷酸序列的载体，通过载体和多核苷酸序列的协同配合，制备获得高活性己糖激酶，比活力高达111.8U/mg；此外还提供了制备重组己糖激酶的方法，该方法不仅提高了己糖激酶的产量，而且所得产物可溶性蛋白含量极高，易于纯化，简化了后处理步骤，节约了生产成本。

技术研发人员：蒋析文,朱伟伟,吴宇鹏,刘春奇,陆雪兰
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25