一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆小分子肽标志物及其应用的制作方法

发明领域本发明属于多肽组学及生殖医学领域，涉及一种与icp辅助诊断相关的血清/血浆小分子肽标志物及其应用。

背景技术：

1、妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,icp)是妊娠期较为常见的一种并发症，其主要发病特征是不明原因的皮肤瘙痒。实验室指标显示血清总胆汁酸水平异常升高，同时可伴有肝酶水平的异常。最新流行病学数据显示icp在国内的发病率为6.1％。icp对胎儿的不良影响较为严重，其可导致胎儿宫内窘迫、自发性早产甚至死胎等不良妊娠结局，增加围产儿发病率和死亡率。有研究指出icp导致的胎儿死亡率约为正常妊娠者的6-10倍，因此对icp进行早期诊断和干预极其重要且迫切。然而，目前临床上对icp疾病的诊断主要依赖于总胆汁酸水平的升高，其敏感性及特异性均较低，不能满足于对该病的早期诊断和预测。因此，探究icp疾病发生的早期敏感分子事件，并筛选易感生物标志物(susceptible biomarker)迫在眉睫，其可为icp疾病的诊断和实施干预提供有效手段，降低该病所引起的母婴并发症，减轻该病给母婴和其家庭带来的疾病痛苦和经济压力，对于促进人类母婴健康具有重大的科学意义。

2、多肽组学(peptidomics)是蛋白质组学的一个新兴的分支学科，其主要研究内容是内源性产生的蛋白质片段，又称为多肽或小分子肽。小分子肽由氨基酸排列组成，分子量小于10kd,被视为可以反映有机体生理状态的蛋白质新陈代谢产物，其具有各自特定的调节和指导生化反应的功能，同时可以评估蛋白酶活性、降解及变性情况等。近年来研究发现，多肽组学是发现新的生物标志物的有效手段。组织或体液中的小分子肽可为疾病提供及时的诊断信息，成为疾病敏感预测标志物筛选的备受关注的组学平台。多肽组学用于妊娠期相关疾病的诊断及发病机制研究已成为一个热门的新兴领域。多肽组学可以从全新角度揭示icp的发病机制并寻找敏感的分子诊断标志物。

3、然而，目前尚未有关于icp辅助诊断的较为稳定的血清小分子肽标志物的报道，若能筛选出icp特异或异常表达的小分子肽作为分子标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将极大改善我国icp的诊断现状。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是针对上述技术问题，提供一种与icp辅助诊断相关的孕期血清/血浆小分子肽标志物。

2、本发明第二个目的是将孕期血清/血浆小分子肽标志物用于icp辅助诊断提供基于质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,mrm)技术的应用。

3、本发明第三个目的是提供用于icp辅助诊断的试剂盒。

4、本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

5、一种与icp辅助诊断相关的血清/血浆小分子肽标志物，该标志物选自leeytkklntq(seq id no.1)或halqlnn(seq id no.2)中的任意一个或两个。

6、所述的血清/血浆小分子肽标志物作为检测靶标在制备icp辅助诊断试剂盒中的应用。

7、检测所述的血清/血浆小分子肽标志物的试剂在制备icp辅助诊断试剂中的应用。

8、一种妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒，该试剂盒包含检测本发明所述的血清/血浆小分子肽标志物的试剂和耗材。

9、作为本发明的一种优选，该试剂盒包括采用mrm技术检测权利要求1所述的血清/血浆小分子肽标志物的试剂和耗材。

10、作为本发明的进一步优选，所述诊断试剂盒，该试剂盒含有leeytkklntq和halqlnn的目标肽段标准品，色谱柱(beh-c18柱，1.7μm，2.1×100mm)，尿素,乙酸，双蒸水，甲酸，乙腈，甲醇，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，三氟乙酸和蛋白酶抑制剂。

11、本发明的发明点在于发现leeytkklntq和halqlnn任意一个或两个组合可以作为icp辅助诊断相关的血清/血浆小分子肽标志物。

12、具体地说，本发明血清/血浆小分子肽标志物通过以下方法筛选得到：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)icp患者血清多肽组学分析：选择icp病例、与icp病例年龄匹配的健康女性对照，采用tmt标记和lc-ms/ms质谱技术检测icp病例及对照组血清中各小分子肽的含量，分析icp病例和健康女性对照间小分子肽的共性和特性，筛选差异表达小分子肽。(3)筛选疾病特异血清/血浆小分子肽：对已筛选的血清/血浆差异表达小分子肽在大样本人群中进行定量分析，确定icp特异性血清/血浆小分子肽。

13、本发明的有益效果：

14、本发明提供的血清/血浆小分子肽标志物作为icp诊断的标志物的优越性在于：

15、本发明以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，患者年龄等因素对于发病的影响)，并采用基于tmt标记和lc-ms/ms质谱技术的多肽组学方法，通过研究初产、单胎妊娠的icp病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照组织/血清中小分子肽的变化，发现一组与icp发病高度相关的高特异性和敏感性的小分子肽，多因素logistic回归分析结果表明，leeytkklntq和halqlnn与icp的发病存在着显著关联，其roc如附图1-3所示，可为icp的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

16、本发明初期采用多肽组学研究的方法获取icp患者血液中特异和异常表达的小分子肽表达谱，并同时应用mrm技术在icp大样本血清中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆小分子肽标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

17、本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆小分子肽标志物在icp诊断的应用前景，阐述异常表达的血清/血浆小分子肽标志物对于icp进展的影响，揭示其对icp的诊断价值。因此，本发明获得了icp发病特异性血清/血浆小分子肽表达数据库和特异性标志物；通过血清/血浆小分子肽标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得icp的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确诊断icp及采取治疗措施奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

技术特征：

1.一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆小分子肽标志物，其特征在于该标志物选自seq id no.1或seq id no.2所示的任意一个或两个多肽。

2.权利要求1所述的血清/血浆小分子肽标志物作为检测靶标在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂中的应用。

3.检测权利要求1所述的血清/血浆小分子肽标志物的试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒中的应用。

4.一种妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包含检测权利要求1所述的血清/血浆小分子肽标志物的试剂和耗材。

5.根据权利要求4所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括采用mrm技术方法检测权利要求1所述的血清/血浆小分子肽标志物的试剂和耗材。

6.根据权利要求5所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括leeytkklntq和halqlnn的目标肽段标准品，色谱柱:beh-c18柱，1.7μm，2.1×100mm，尿素,乙酸，双蒸水，甲酸，乙腈，甲醇，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，三氟乙酸和蛋白酶抑制剂。

技术总结
本发明公开了一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆小分子肽标志物及其应用。一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆小分子肽标志物，由LEEYTKKLNTQ和HALQLNN组成。定量检测血清/血浆小分子肽标志物的试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆辅助诊断试剂中的应用。本发明通过分离和研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆中的小分子肽标志物，寻找一组与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的小分子肽标志物，并研制出可便于临床应用的ICP辅助诊断试剂盒，为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

技术研发人员：董蕊锐,张婷,罗亮,孙秀兰,孙嘉笛,叶宁珍,史新蕊,王晶,陈敏健,王高莹
受保护的技术使用者：无锡市妇幼保健院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12