可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种可被靶向清除的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤的发生、发展依赖于肿瘤细胞与微环境中细胞的交互对话，肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,cafs)是肿瘤微环境中最重要的细胞之一。多项研究发现，在乳腺癌、胰腺癌、口腔癌等肿瘤中，cafs的数量与患者的预后密切相关。cafs可以通过分泌如tgf-b，il6和il1等细胞因子促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤免疫微环境；此外其释放基质金属蛋白酶等参与肿瘤的细胞外基质重塑，诱导肿瘤细胞产生耐药性；cafs也可以通过释放丙氨酸，天冬氨酸、乳酸等小分子代谢物，为肿瘤细胞生长提供能量。因此，明确cafs功能对肿瘤治疗研究至关重要。

2、cafs是肿瘤组织内或肿瘤边界处的一类非上皮细胞、非内皮细胞，非肿瘤细胞，非免疫细胞的细胞，其可以由组织内处于静息状态的成纤维细胞转化而来，也可以由骨髓间充质干细胞、内皮细胞及脂肪细胞分化而来。由于cafs来源的多样性，不同肿瘤或同一肿瘤内cafs的功能也各不相同。例如，乳腺癌内cd146-cafs增强肿瘤细胞对泰莫西芬的抵抗性，而cd146+cafs功能与之相反。当前已有大量研究利用单细胞测序、流式分选及靶向清除cafs等方法研究不同类型cafs的表达谱和功能，其中利用基因工程的手段使细胞表达自杀基因靶向去除cafs是一种可以明确cafs功能的实验方法。

3、大量研究已证明靶向清除cafs有助于明确cafs的来源及其在肿瘤进展中的作用，lebleu等前期通过靶向去除tgfbr2+αsma+细胞，证明tgfbr2信号途径影响肌成纤维细胞招募。mertens等证明体内靶向诱导caf凋亡能抑制肿瘤细胞生长并延长小鼠生存。目前常用的靶向去除cafs的方法之一是单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidinekinase，hsvtk)介导的细胞死亡，hsvtk可以诱导更昔洛韦(ganciclovir，gcv)发生磷酸化，形成三磷酸脱氧胸苷，而当细胞快速增殖时，三磷酸脱氧胸苷会整合入正在合成的dna中，抑制dna合成，诱导细胞死亡。虽然hsvtk自杀系统已在转基因小鼠模型中用于研究cafs功能，但尚缺乏hsvtk自杀系统靶向清除cafs对共培养肿瘤细胞作用的评价。因此，本研究拟构建cafs-hsvtk细胞，通过体外共培养模型和迁移模型，比较gcv诱导的cafs-hsvtk死亡对肿瘤细胞增殖，迁移的影响，明确应用hsvtk自杀系统靶向清除cafs研究不同亚型cafs功能的可行性。这是本发明要解决的问题。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可被靶向清除的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用，为明确不同亚型cafs的功能提供一种新方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞，所述肿瘤相关成纤维细胞染色体携带序列如seq id n0:1的多核苷酸片段。

3、其中，所述肿瘤相关成纤维细胞具有与其他肿瘤相关成纤维细胞相当的形态和体外生长速率。

4、所述肿瘤相关成纤维细胞在于其他肿瘤相关成纤维细胞共培养时，可被药物特异性的诱导死亡，所述的药物为更昔洛韦，更昔洛韦药物浓度范围为1-100μm。

5、本发明进一步提出了上述的肿瘤相关成纤维细胞的构建方法，包括如下步骤：

6、(1)构建由cmv启动子调控表达seq id no:1多核苷酸片段的质粒：在pcdh质粒载体基础上，经xba i和bamh i限制性内切酶切割后，将载体与包含seq id no:1的多核苷酸片段连接，得到连接载体，然后转入stbl3甘油菌中，所得克隆进行测序鉴定，获得由cmv启动子调控表达seq id no:1多核苷酸片段的质粒；其中包含seq id no:1的多核苷酸片段的正义链片段(seq id no:2)为序列为seq id no:1多核苷酸片段的5’端添加ctaga，3’端添加g，反义链(seq id no:3)为seq id no:1多核苷酸片段的5’端添加gatcc，3’端添加t，获得的连接载体；

7、(2)将步骤(1)得到的质粒与包装质粒和转染试剂混合混合转染293t细胞，获得含由cmv启动子调控表达seq id no:1多核苷酸片段质粒的慢病毒，然后以肿瘤相关成纤维细胞为出发细胞，应用慢病毒将构建的质粒转染至肿瘤相关成纤维细胞中；其中，包装质粒选择pspax2和pmd2.g质粒，转染试剂可选用polyjet或lipo3000用量可以根据常规用量调节。

8、(3)利用1μg/ml嘌呤霉素对步骤(2)获得的肿瘤相关成纤维细胞进行筛选后，荧光显微镜观察和q-pcr鉴定。

9、本发明进一步提出了上述肿瘤相关成纤维细胞在制备人肿瘤相关成纤维细胞模型中的用途。

10、具体地，所述用途包括：将所述肿瘤相关成纤维细胞与其他肿瘤细胞共培养，构建共培养肿瘤细胞增殖模型。

11、在该用途中，将所述肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞共培养，混合比例按照体积比为1:0.5～2，然后用更昔洛韦处理，观察肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞增殖的作用。

12、作为另外一种应用，将所述肿瘤相关成纤维细胞与接种于transwell下室，肿瘤细胞接种于transwell上室，构建肿瘤细胞迁移模型。

13、在该应用中，利用更昔洛韦可诱导新的肿瘤相关成纤维细胞死亡，削弱肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用，明确肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用。

14、有益效果：本发明提供了一种全新的、方便的研究不同亚型cafs功能的细胞构建方法及其应用，该新型cafs在更昔洛韦处理下，会靶向死亡，削弱该类型cafs对共培养肿瘤细胞的作用，能帮助有效区分不同亚型cafs在肿瘤发生发展中的作用。

15、具体地，具有如下优点：

16、(1)与cre-loxp敲除系统相比，该方法操作简单、方便、经济，仅需一步克隆和一步转染即可得到目标细胞；

17、(2)该方法靶向行强，高浓度更昔洛韦处理后，80％新的cafs细胞死亡，而原始cafs细胞生存无影响；

18、(3)该方法应用广泛，可应用于二维或3d共培养模型，帮助明确cafs在肿瘤发生发展中的作用。

技术特征：

1.一种可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞，其特征在于，所述肿瘤相关成纤维细胞染色体携带序列如seq id no:1的多核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的肿瘤相关成纤维细胞，其特征在于，所述肿瘤相关成纤维细胞具有与其他肿瘤相关成纤维细胞相当的形态和体外生长速率。

3.根据权利要求1所述的肿瘤相关成纤维细胞，其特征在于，所述肿瘤相关成纤维细胞在于其他肿瘤相关成纤维细胞共培养时，可被药物特异性的诱导死亡，所述的药物为更昔洛韦，更昔洛韦药物浓度范围为1-100 μm。

4.权利要求1所述的肿瘤相关成纤维细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.权利要求1-3任一项所述的肿瘤相关成纤维细胞在制备人肿瘤相关成纤维细胞模型中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途包括：将所述肿瘤相关成纤维细胞与其他肿瘤细胞共培养，构建共培养肿瘤细胞增殖模型。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞共培养，混合比例按照体积比为1:0.5~2，然后用更昔洛韦处理，观察肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞增殖的作用。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途包括：将所述肿瘤相关成纤维细胞与接种于transwell下室，肿瘤细胞接种于transwell上室，构建肿瘤细胞迁移模型。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，利用更昔洛韦可诱导新的肿瘤相关成纤维细胞死亡，削弱肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用，明确肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用。

技术总结
本发明公开了一种可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞，所述肿瘤相关成纤维细胞染色体携带序列如SEQ ID No:1的多核苷酸片段，所述肿瘤相关成纤维细胞具有与其他肿瘤相关成纤维细胞相当的形态和体外生长速率。所述肿瘤相关成纤维细胞在于其他肿瘤相关成纤维细胞共培养时，可被药物特异性的诱导死亡，所述的药物为更昔洛韦，更昔洛韦药物浓度范围为1‑100μM。本发明提供了一种全新的、方便的研究不同亚型CAFs功能的细胞构建方法及其应用，该新型CAFs在更昔洛韦处理下，会靶向死亡，削弱该类型CAFs对共培养肿瘤细胞的作用，能帮助有效区分不同亚型CAFs在肿瘤发生发展中的作用。

技术研发人员：张晓昕,泥艳红,井玥,宋玉仙,王雨晗,翁佩
受保护的技术使用者：南京市口腔医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11