一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的RAA引物、探针及方法

本发明涉及禽病毒检测，具体涉及一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的raa引物、探针及方法。

背景技术：

1、禽网状内皮组织增生症是由禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus，rev)感染导致的肿瘤性传染病。rev主要侵害家禽的淋巴系统，引起严重的免疫抑制。rev可通过种蛋垂直传播，是种源需要净化的病毒之一，同时携带rev的spf鸡胚用于生产弱毒疫苗会造成疫苗中污染rev。

2、目前，针对鸡群中rev的检测标准主要是中华人民共和国行业标准《禽网状内皮组织增殖症检疫技术规范》(sn/t 4917-2017)。这个技术规范主要采用了传统的细胞接种法和聚合酶链式反应(pcr)。但是，细胞接种法周期长、技术要求高、操作难度大，聚合酶链式反应较为快速便捷，但存在一定程度假阳性或假阴性的问题。而对于疫苗中rev病毒污染的检测，目前《中华人民共和国兽药典》中指定的方法是包括细胞培养检查法以及经典的spf鸡检查法，但是绝大多数疫苗(如mdv活疫苗)的检测非常复杂和困难，这是因为mdv等接种鸡胚成纤维细胞后能够产生细胞病变，使污染的病毒复制受到干扰。尽管经典的spf鸡检查法相对可靠，但其周期较长成本也比较高，更重要的是对于一般种禽场存在困难，因为这需要特定的设备并要求长期饲养spf鸡备用。因此发展先进的分子生物学检测方法来检测疫苗中rev污染极为重要。

3、raa技术(重组酶介导链替换核酸扩增技术)是一种恒温核酸快速扩增技术。利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶引物聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链dna结合蛋白的帮助下，打开模板dna的双链结构，并在常温dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，可以实现定时定量的结果分析，通常15-20分钟即可得到荧光检测结果。该技术目前已经在多种病原检测领域中获得广泛应用。但目前还未见有利用raa技术检测rev的相关报道。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的raa引物、探针及方法。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的raa引物-探针组合，包括：上游引物、下游引物和探针；

4、所述上游引物和下游引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所；所述探针的序列如seq id no.4所示。具体如下：

5、上游引物：caaccaaaccttgcttaagtccctacaggccc；

6、下游引物：cggaggttggtgagacagtccattcttcttgg。

7、探针：accgtaccccactgttccaacctggtgatc[fam-dt][thf]g[bhq1-dt]cttcgtcaagaaacacg[c3-spacer]。

8、优选的，所述探针的修饰如下：

9、(1)探针的第31位胸腺嘧啶脱氧核糖核酸修饰有荧光报告基团fam；

10、(2)探针的第31位碱基之后增加一个碱基核苷酸类似位点[thf]；

11、(3)探针的第33位胸腺嘧啶脱氧核糖核酸修饰有荧光淬灭基团bhq1；

12、(4)探针的3’端修饰有[c3-spacer]。

13、本发明对探针进行了修饰处理，在探针中引入四氢呋喃(thf)修饰位点，c3间臂(c3spacer)为封闭基团，用于阻止探针自连后的扩增。

14、本发明的第二方面，提供上述raa引物-探针组合在制备检测禽网状内皮组织增生症病毒的试剂盒中的应用。

15、本发明的第三方面，提供一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物-探针组合。

16、进一步的，所述试剂盒中还包括：反应干粉、a buffer、b buffer和携带rev全基因组序列的质粒标准品。

17、本发明的第四方面，提供一种利用上述试剂盒检测禽网状内皮组织增生症病毒的方法，包括如下步骤：

18、提取待测样品的基因组dna，以基因组dna作为作为模板，构建rpa检测体系，进行扩增反应，收集荧光信号，根据荧光扩增曲线分析待测样本中是否含有禽网状内皮组织增生症病毒。

19、优选的，所述rpa检测体系包括：反应干粉1管，a buffer 40.9μl，b buffer 2.5μl，上游引物2.0μl，下游引物2.0μl，探针0.6μl，样本2.0μl。

20、优选的，扩增反应的温度为39℃。

21、优选的，根据荧光扩增曲线的出峰时间来判定待测样本中是否含有禽网状内皮组织增生症病毒；若出峰时间≤19.5min，则判定为阳性，若出峰时间＞19.5min，则判定为阴性。

22、本发明的有益效果：

23、本发明设计了针对rev的引物和探针，建立了实时荧光raa检测rev的方法，在39℃下等温反应20min，即可实现对靶基因的有效扩增，检测的灵敏度可达102copies/μl，与taqman荧光定量pcr灵敏度相当。本方法仅能检测到rev核酸，与鸡马立克氏病病毒、禽白血病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽戊型肝炎病毒以及禽腺病毒等病毒核酸均未表现出交叉反应，具有良好的特异性。最重要的优势在于，得益于raa方法的高灵敏度，该方法既可以用作鸡群中rev感染的检测，又可以用于禽用弱毒疫苗中rev污染的检测，从而为rev的检测和防控提供了技术保障。

技术特征：

1.一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的raa引物-探针组合，其特征在于，包括：上游引物、下游引物和探针；

2.根据权利要求1所述的raa引物-探针组合，其特征在于，所述探针的修饰如下：

3.权利要求1或2所述的引物-探针组合在制备检测禽网状内皮组织增生症病毒的试剂盒中的应用。

4.一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物-探针组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：反应干粉、abuffer、b buffer和携带rev全基因组序列的质粒标准品。

6.一种利用权利要求4或5试剂盒检测禽网状内皮组织增生症病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述rpa检测体系包括：反应干粉1管，abuffer 40.9μl，b buffer 2.5μl，上游引物2.0μl，下游引物2.0μl，探针0.6μl，样本2.0μl。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增反应的温度为39℃。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，根据荧光扩增曲线的出峰时间来判定待测样本中是否含有禽网状内皮组织增生症病毒；若出峰时间≤19.5min，则判定为阳性，若出峰时间＞19.5min，则判定为阴性。

技术总结
本发明公开了一种检测禽网状内皮组织增生症病毒的RAA引物、探针及方法，属于禽病毒检测技术领域。本发明设计了针对REV的引物和探针，建立了实时荧光RAA检测REV的方法，在39℃下等温反应20min，即可实现对靶基因的有效扩增。本方法仅能检测到REV核酸，与鸡马立克氏病病毒、禽白血病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽戊型肝炎病毒以及禽腺病毒等病毒核酸均未表现出交叉反应，具有良好的特异性。最重要的优势在于，得益于RAA方法的高灵敏度，该方法既可以用作鸡群中REV感染的检测，又可以用于禽用弱毒疫苗中REV污染的检测，从而为REV的检测和防控提供了技术保障。

技术研发人员：赵鹏,王明月,王一新,常爽
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13