结合死亡受体4和死亡受体5的抗体的制作方法

本发明整体涉及单克隆抗体(mab)和用于开发新生物制剂的重组dna技术的组合，更具体地，涉及例如结合并活化死亡受体4和5的单克隆抗体的生产。

背景技术：

1、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail，也称为apo2配体，还称为apo2l或apo2l/trail)是tnf配体超家族的成员(综述于iam van roosmalen等，biochem pharmacol 91:447-456，2014)。trail以刺激依赖性方式在免疫系统的许多细胞上表达并调节免疫应答，例如作为nk细胞介导的细胞毒性中的关键效应分子(c falschlehner等，immunol 127：145-154,2009)。trail通过与细胞膜受体死亡受体4(dr4，也称为trail-r1)和/或死亡受体5(dr5，也称为trail-r2或apo2)结合来激活外源性凋亡途径，从而诱导杀死易感细胞。更具体地说，这种有活性的、可溶形式的trail是自组装的、非共价的同源三聚体，它以高亲和力结合三种受体分子的胞外结构域。这种结合诱导细胞内死亡结构域的寡聚化，和同聚或异聚复合物的形成(fc kischkel等，immunity 12：611-620,2000)，随后募集具有死亡结构域(fadd)的fas相关蛋白，并形成死亡诱导信号复合体(disc)。该死亡诱导信号复合体能导致半胱天冬酶的激活，然后是凋亡，细胞程序性死亡(参见van roosmalen等.,如前文所引用)。

2、许多癌细胞表达了dr4和/或dr5，并且trail能够选择性诱导癌细胞的凋亡(综述于j lemke等，cell death differ 21：1350-1364，2014)以及在肿瘤内皮细胞呈交联形式(nswilson等，cancer cell 22:80-90，2012)。trail本身和各种trail受体激动剂已经被证明对癌细胞系和临床前模型具有强抗肿瘤活性(例如，a ashkenazi等，j clin invest104:155-162,1999)。这些包括由人trail的胞外区组成的重组人trail(rhtrail；dulanermin)(r pitti等，j.biol chem 271：12687-12690,1996)和许多针对dr4或dr5的激动剂单克隆抗体(mab)，包括鼠源的，嵌合的，人源化的和人单克隆抗体(mabs)(参见vanroosmalen等，如前所引)。此类mab包括针对dr4的4h6.17.8mab(本文称为4h6；美国专利no.7,252,994)和mapatumumab(hgs-etr1；pukac等，br j cancer 92:1430-1441,2005)；以及针对dr5的3h3.14.5mab(本文称为3h3；美国专利no.6,252,050)、conatumumab(amg 655；p kaplan-lefko等，cancer biol ther 9:618-631,2010)、drozitumab(apomab；c adams等.,cell death differ15:751-761,2008)、lexatumumab(hgs-etr2；ggeorgakis等，br jhaematol 130：501-510,2005)和tra-8及其人源化形式的tigatuzumab(cs-1008，a yada等.,ann oncol 19:1060-1067,2008)；以及van roosmalen所列的其他mabs(如前所引，见第450页的表1)。

3、然而，尽管所有这些药物在体外以及通常的动物模型中能够非常有效地杀死肿瘤细胞(参见上文引用的参考文献)，但是它们中的任何一种在临床试验中都没有表现出强的活性，无论是单独使用还是与其他药剂组合使用，并且没有一种进入iii期试验(综述于pmholland，cytokine growth factor rev 25:185-193,2014以及lemke等，如前所引。特别参见holland的表1和lemke等的表2和3，和其中引用的参考文献)。对于mabs，一个原因可能是有交联mabs的要求，以此寡聚化死亡受体以触发凋亡途径。这样的要求可以通过在体内将mabs的fc结构域与免疫细胞上的fcγ受体(fcγr)结合而体内满足，但浸润肿瘤的免疫细胞可能太少，或者这种结合可能不具有足够高的亲和力。癌细胞也可能表达凋亡蛋白的抑制剂(见lemke等，如前所引)。为了改善功效，人们正在开发trail的修饰形式，包括与其他蛋白结构域融合以增强稳定性、寡聚和/或靶向(lemke等，如前所引和holland，如前所引)。同样地，已开发出了包含多个结合dr4和/或dr5的抗体结构域的结构体(k miller等，jimmunol 170：4854-4861,2003；w wang等，immunol cell biol 91:360-367,2013；jeallen等.，mol cancer ther 11:2087-95，2012；h huet等，cancer res 72abstract 3853,2012；wo 2014/022592；wo 2015/017822)，但这些结构体还没进入临床试验，或是在临床试验中未取得成功(kp papadopoulos等，cancer chemother pharmacol；feb 27，2015，pmid：25721064)；它们非常不自然的结构可能会限制它们的临床效用。在另一种方案中，trail和抗dr5 mab amg655的组合或联合用药比其单独的任一种药剂在体外和体内更有效(jdgraves等.，cancer cell 26：177-189,2014)。

技术实现思路

1、本发明提供了与dr4和dr5结合的单克隆抗体(mab)，如d114和g4.2以及它们的人源化形式。在一个实施方案中，本发明提供了包含两对重链和轻链的双特异性单克隆抗体，其中每个重链/轻链对包含一个结合dr4的结构域和一个结合dr5的结构域。在其他实施方案中，本发明提供了具有4个结合dr4的结构域或4个结合dr5的结构域的多聚体mab。在优选的实施方案中，该抗体具有bs(scfv)4-igg抗体的形式，该术语定义见下文。在任何双特异性或多聚体mabs中，每个结合结构域优选为来自人源化的或人mab，例如d114和g4.2的人源化形式。而且，本发明的任何mab可以含有恒定区，所述恒定区包含增强与细胞fcγ受体(fcγr)结合的突变，例如fcγriib，例如γ-1恒定区中的s267e和/或l328f突变(根据基于eu索引的kabat编号)，优选两个或更多个此类突变。有利的是，mab抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。另一方面，本发明提供了包含任何这些mabs的药物组合物。第三个方面，对患者给予这种药物组合物来治疗癌症或其它疾病。

1.一种与死亡受体5结合的单克隆抗体(mab)，其包含轻链v区和重链v区，所述轻链v区具有三个cdr，所述轻链v区的三个cdr的序列分别如seq id no：26-28所示，所述重链v区具有三个cdr，所述重链v区的三个cdr的序列分别如seq id no：29-31所示。

2.根据权利要求1所述的mab，其是人源化抗体。

3.根据权利要求2所述的mab，其包含具有与hug4.2-l1(seq id no：13)或hug4.2-l2(seq id no：14)至少90％序列同一性的轻链v区，和具有与hug4.2-h1(seq id no：17)或hug4.2-h2(seq id no：18)至少90％序列同一性的重链v区，其中kabat编号的轻链位置4和68分别被l和r占据，kabat编号的重链位置27、28、30和93分别被l、p、n和t占据。

4.根据权利要求2所述的mab，其包含具有hug4.2-l1(seq id no：13)或hug4.2-l2(seqid no：14)序列的轻链v区和具有hug4.2-h1(seq id no：17)或hug4.2-h2(seq id no：18)序列的重链v区。

5.根据权利要求1所述的mab，其抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。

6.根据权利要求1所述的mab，其是双特异性抗体。

7.根据权利要求1所述的mab，其包含人恒定区，所述人恒定区具有一个或者多个增加与人fcγ受体结合的突变，并且所述一个或多个突变为s267e和l328f突变中的一个或两个。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。

9.权利要求1-8任一项的mab在制备治疗癌症的药物中的应用。