减少交叉污染的扩增子测序文库的构建方法与流程

本发明属于基因测序，具体涉及一种减少交叉污染的扩增子测序文库的构建方法。

背景技术：

1、随着近年来资讯通量的激增，高通量测序技术在生命科学及医学领域方面的研究和应用越来越广泛，特别是在疾病诊断及预防中发挥重要作用，其主要表现在产前筛查、肿瘤诊断、重大疾病预防、健康相关宏基因组分析等方面。虽然人类全基因组测序从测序时间和资金花费上已有了巨大的飞跃，但庞大的数据分析和遗传信息提取将费时费力，相比较而言，全外显子测序、基因panel的测序将直击可能引起疾病的大部分基因序列，而扩增子测序更强的目的性及快速的数据分析和少量资金花费等优点将更有利于用于临床疾病检测，如作为新生儿筛查的二线检测，采用illumina第二代高通量测序平台对新生儿样本进行某些先天代谢疾病基因深度测序，能灵敏地将那些携带先天疾病的新生儿在临床症状尚未表现之前或表现轻微时检测出来，通过筛查，得以早期诊断、早期治疗，防止机体组织器官发生不可逆的损伤。

2、聚合酶链反应(即pcr)是一种广泛运用于分子遗传和诊断的技术，用于放大扩增特定的dna片段，可看作是生物体外的特殊dna复制。pcr的最大特点是将样品中微量的dna大幅增加，达到可检测的水平。扩增子测序则是对特定长度的pcr产物或者捕获的片段进行测序，由于低廉的价格和简便的操作，多重pcr是目标区段富集技术的重要手段。面对大量复杂基因组样本的目标区段捕获，多重pcr技术由于特异性强、价格低、重复性好等优点，已成为首选技术。

3、目前，基于illumina测序平台的扩增子建库主要采用传统的两步扩增建库方法，即使用两对引物进行两轮pcr进行建库。两对引物的两步扩增方法虽然可以直接使用illumina相配套的试剂进行测序，但建库过程中当样本量较多时，而且，由于在第一轮扩增时没有加入样本标签，使后续操作繁琐且容易引起样本间的交叉污染。即常用的两轮pcr扩增子建库方法一方面需对每个样本单独建库，不能将大批量的样本合并统一处理，操作繁琐、建库效率低，易引起样本间的交叉污染；另一方面，在多重pcr反应中，随着引物对数的增加，引物二聚体和非特异扩增产物会急剧增加，进而导致不同目标片段的拷贝数差异巨大，无法得到均一的产物；再次，采用的建库引物合并了公用序列，使引物合成时不仅需要合成大量的特异性引物，还需合成等量的公用序列，耗费成本大，同时由于引物序列太长，降低了pcr扩增效率，文库的覆盖度及均一性受到影响。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种扩增子测序文库的构建方法及引物组和试剂盒，旨在解决现有扩增子两步建库法的效率低、成本高，以及文库的覆盖度和均一性差的技术问题。

2、为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明一方面提供一种扩增子测序文库的构建方法，包括如下步骤：

4、获得样本dna；

5、利用第一引物、第二引物和第三引物对所述样本dna进行第一pcr扩增，得到扩增产物；

6、利用第四引物和第五引物对所述扩增产物进行第二pcr扩增，得到扩增子测序文库；

7、其中，

8、所述第一引物从5’端到3’端依次为第一测序标签序列和扩增子特异性正向引物；

9、所述第二引物从5’端到3’端依次为第二测序标签序列和扩增子特异性反向引物；

10、所述第三引物从5’端到3’端依次为第二测序接头序列、样本标签序列和所述第二测序标签序列；

11、所述第四引物从5’端到3’端依次为第一测序接头序列和所述第一测序标签序列；

12、所述第五引物为所述第二测序接头序列。

13、本发明提供的扩增子测序文库的构建方法中，首先提取样本dna，然后利用本发明设计的引物组进行两轮pcr扩增得到；在两轮pcr扩增中：先以第一引物、第二引物和第三引物进行第一轮pcr得到所有扩增子目的片段，该过程中对不同样本来源的所有扩增子目的片段的5’端加上第一测序标签序列，3’端加上依次连接的第二测序标签序列、样本标签序列和第二测序接头序列，因样本标签序列可标记不同的样本，所以第一轮pcr扩增完成后即可将所有样本的扩增产物合并为一管，然后以第一轮pcr的纯化产物为模板，用第四引物和第五引物进行第二轮pcr，将第一测序接头序列添加到第一轮pcr扩增产物的5’端，从而完成扩增子测序文库的构建。该构建方法可大大地节省试剂和工作量，降低成本，而且两轮pcr的扩增效率都很高，最终构建的扩增子测序文库具有更好的覆盖度和均一性。

14、本发明另一方面提供一种用于扩增子测序文库构建的引物组，所述引物组包括：用于第一pcr扩增的第一引物、第二引物和第三引物，以及用于第二pcr扩增的第四引物和第五引物；其中，

15、所述第一引物从5’端到3’端依次为第一测序标签序列和扩增子特异性正向引物；

16、所述第二引物从5’端到3’端依次为第二测序标签序列和扩增子特异性反向引物；

17、所述第三引物从5’端到3’端依次为第二测序接头序列、样本标签序列和所述第二测序标签序列；

18、所述第四引物从5’端到3’端依次为第一测序接头序列和所述第一测序标签序列；

19、所述第五引物为所述第二测序接头序列。

20、本发明提供的用于扩增子测序文库构建的引物组，第一引物、第二引物和第三引物用于第一pcr扩增，第四引物和第五引物用于第二pcr扩增；该引物组用于扩增子测序文库构建时，在第一轮pcr扩增过程中，可通过该特有结构的三条引物(第一引物、第二引物和第三引物)使所有扩增子目的片段的5’端加上第一测序标签序列，3’端加上依次连接的第二测序标签、样本标签序列和第二测序接头序列，因样本标签序列可标记不同的样本，所以第一pcr扩增完成后即可将所有样本的扩增产物合并为一管，然后直接用第四引物和第五引物进行第二pcr扩增，完成测序文库构建，这样可大大地节省试剂和减少工作量；而且第三引物中的第二测序接头序列、样本标签序列和第二测序标签序列与扩增子引物(即扩增子特异性正向引物和扩增子特异性反向引物)分开，这使得第三引物的使用更加灵活，当一个样本检测n个扩增子时，需要n对特异性引物即第一引物和第二引物，但只需一条第三引物，即只需合成2n+1条引物，可见当扩增子数量和样本量较大时，本发明用于建库的引物组将大大的降低引物合成的成本，而且该引物组中的引物相对现有的引物可以更短，这样可进一步提高pcr扩增效率，可构建具有更好的覆盖度和均一性的扩增子测序文库。

21、最后，本发明还提供一种用于扩增子测序文库构建的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的上述引物组。

22、本发明的试剂盒中含有本发明特有的引物组，用该试剂盒进行扩增子测序文库构建时，可节省试剂和工作量，降低成本，而且可进一步提高pcr扩增效率，可构建具有更好的覆盖度和均一性的扩增子测序文库。

技术特征：

1.一种减少交叉污染的扩增子测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述样本的dna来自人的血液、唾液和组织样本中的任一种或多种。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述扩增子特异性正向引物和所述扩增子特异性反向引物根据目的基因pah、pts、slc25a13、slc22a5、mmachc、mut、pcca、pccb、mccc1、mccc2、ivd和otc的外显子区进行特异性设计得到。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述第一pcr扩增包含275个扩增子，在所述第一pcr扩增的步骤中，每个样本分为两个多重pcr反应体系进行pcr扩增，所述两个多重pcr反应体系包括第一多重pcr反应体系和第二多重pcr反应体系，其中，所述第一多重pcr反应体系包含139个扩增子，所述第二多重pcr反应体系包含136个扩增子。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述第一多重pcr反应体系由15.5μl的pcr buffer、0.5μl的所述第一引物的混合池、0.17μl的所述第二引物混合池、1.39μl的所述第三引物、0.6μl的dna聚合酶、3μl的所述样本的dna和3.84μl的水组成。

6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述第二多重pcr反应体系由15.5μl的pcr buffer、0.5μl的所述第一引物的混合池、0.17μl的所述第二引物的混合池、1.36μl的所述第三引物、0.6μl的dna聚合酶、3μl的所述样本的dna和3.87μl的水组成。

7.如权利要求1或4所述的构建方法，其特征在于，在所述第一pcr扩增的步骤中，选择62℃、60℃和58℃三个平行梯度的退火温度。

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述第一pcr扩增的pcr程序为95℃持续3分钟，随后以95℃持续30秒、62℃持续2分钟、60℃持续2分钟和58℃持续2分钟的程序进行17个循环，再72℃持续3分钟，最后保持4℃。

9.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述第二pcr扩增的反应体系由25μl的2x kapa hifi hotstart ready mix、1.5μl的所述第四引物、1.5μl的所述第五引物、10μl的所述第一pcr扩增的扩增产物和12μl的水组成。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述第二pcr扩增的pcr程序为95℃持续3分钟，随后以95℃持续20秒、60℃持续15秒、72℃持续30秒的程序进行10个循环，再72℃持续3分钟，最后保持4℃。

技术总结
本发明描述了一种减少交叉污染的扩增子测序文库的构建方法，包括如下步骤：获得样本DNA；利用第一引物、第二引物和第三引物对样本DNA进行第一PCR扩增，得到样本的扩增产物；进行纯化；利用第四引物和第五引物对纯化产物进行第二PCR扩增，得到扩增子测序文库；其中，第一引物从5’端到3’端依次为第一测序标签序列和扩增子特异性正向引物；第二引物从5’端到3’端依次为第二测序标签序列和扩增子特异性反向引物；第三引物从5’端到3’端依次为第二测序接头序列、样本标签序列和第二测序标签序列；第四引物从5’端到3’端依次为第一测序接头序列和第一测序标签序列；第五引物为第二测序接头序列。根据本发明，能够提供一种减少交叉污染的测序文库的构建方法。

技术研发人员：郭永超,王艳平,雷湘华,谭爱女
受保护的技术使用者：深圳联合医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12