本发明涉及一种脉冲式热刺激诱导方式，属于微生物发酵。
背景技术：
1、大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、培养周期短、转化效率高、表达水平高、容易操作等特点，是发展最早、应用最广泛、最容易操作的高效表达系统。而基因表达系统的强弱在于诱导调控方式的高效程度，目前调控类型的表达载体主要包括糖原调控型、温度调控型、色氨酸调控型、磷酸盐调控型、ph调控型、溶氧调控型、生物素调控型、光调控型等。糖原调控型是现阶段最广泛的调控方式，通过lac/tac表达系统采用化学诱导剂解除阻遏蛋白抑制表达出目的蛋白，但最有效的化学诱导剂异丙基硫代-β-半乳糖苷（iptg）价格昂贵且具有细菌毒性，不具备工业价值。而温度调控诱导方式避免了使用特殊的介质、昂贵的化学诱导剂，克服了其他表达系统的缺点，目前已经成功应用到药用重组蛋白的生产中。中国专利200410065776.8公开了“预热-注入法”可以实现大体积发酵液的快速升温，但在诱导过程中需一直维持诱导温度直至诱导结束，诱导时间较长，持续的能量需要大量的能量供应，较长的诱导周期耗费大量的时间成本，基于此，本发明公开了一种脉冲式热刺激诱导方式。
技术实现思路
1、针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种脉冲式热刺激诱导方式，与传统热刺激诱导方式相比，仅需提供诱导的瞬时温度，能够减少能量供应成本；诱导时间缩短，节约时间成本。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种脉冲式热刺激诱导方式，具体方法包括以下步骤：
3、步骤a1、将基因工程菌株shg13-s接种至lb液体培养基中，培养，当发酵培养液的细胞光密度od600为0.4~1.3时，开始脉冲式热刺激诱导；
4、步骤a2、向发酵培养液中加入热的lb液体培养基，使发酵培养液瞬间达到目标温度为tt，在诱导周期内进行n次热刺激诱导，每次热刺激诱导的间隔为10~15min；
5、每次热刺激诱导时，先确定测定发酵培养液的温度tn、体积vn，再以纯水代表发酵培养液、热水代表热的lb液体培养基，以确定每次加入热的lb液体培养基的体积vxn，热的lb液体培养基与热水的温度相同且大于tt；
6、其中，n表示脉冲式热刺激的诱导周期内的脉冲频率，tn表示第n次热刺激前发酵培养液的温度，vn表示第n次热刺激前发酵培养液的体积，vxn表示第n次热刺激加入的100℃的lb液体培养基体积；lb液体培养基配方：每升中，蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，其余为纯水，ph 7.0；
7、基因工程菌株shg13-s是以大肠杆菌为起始菌株，先敲除阻遏基因再敲入标签基因培养，再导入连接目的基因的线性化温敏型表达载体构建得到。
8、其中，上述目标温度tt为40~45℃。
9、其中，上述n为1~11次。
10、其中，上述诱导周期为1~2h。
11、其中，上述每次加入热的lb液体培养基的体积vxn的具体确定方法为：先确定测定发酵培养液的温度tn、体积vn，取温度tn、体积vn的纯水，快速加入热水，使纯水温度达到目标温度tt后，记录使用的热水的体积，标记为vxn，vxn即为第n次需要加入的热的lb液体培养基。
12、上述基因工程菌株shg13-s的接种量为1%。
13、本发明还提供了基因工程菌株shg13-s经脉冲式热刺激诱导后的应用，具体应用方法如下：将基因工程菌株shg13-s完成脉冲式热刺激诱导的发酵培养液继续培养2~3h，加入底物，使底物达到一定浓度，催化反应9~16h，获得目标产物。
14、其中，上述底物的初始浓度不大于32 g/l。
15、其中，上述底物为含有邻苯基团的化合物。
16、其中，上述底物为4-香豆酸、酪醇、3-脱氢莽草酸、酪氨酸的一种，其对应的目标产物为咖啡酸、羟基酪醇、原儿茶酸、左旋多巴的一种。
17、上述的培养条件为：温度25~37℃，转速225rpm。
18、本发明还提供了基因工程菌株shg13-s的具体构建的过程，包括以下步骤：
19、步骤b1、以大肠杆菌为起始菌株，采用crespre/cas9的基因编辑方式，先敲除阻遏基因再敲入标签基因复苏后，涂布至lb固体培养基，在30℃过夜培养，挑选阳性菌株，得到底盘菌株；lb固体培养基配方：每升中，蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，琼脂20g，其余为纯水，ph 7.0；
20、步骤b2、以温敏质粒pbv220基础，温敏质粒经扩增、消化，获得线性化温敏型表达载体，将目的基因连接到线性化温敏型表达载体中，获得重组质粒；
21、步骤b3、将步骤b2的重组质粒通过化学转化法导入步骤b1的底盘菌株中，在37℃过夜培养，待长出菌株后，筛选阳性菌株，获得基因工程菌株shg13-s。
22、其中，上述大肠杆菌为大肠杆菌代谢菌株，大肠杆菌代谢菌株为大肠杆菌bl21、大肠杆菌w3110、大肠杆菌atcc9637的一种。
23、其中，上述目的基因为hpabc、quic、tpl的一种；hpabc的核苷酸序列由seq idno.11所示的hpab和seq id no.12的hpac组合而成；quic的核苷酸序列为seq id no.13所示；tpl的核苷酸序列为seq id no.14所示。
24、其中，pbv220的核苷酸序列为seq id no.15所示。
25、其中，上述阻遏基因tyrr、trpr、mtr、tnaa、arop的一处或多处。
26、其中，上述标签基因序列可为重复序列，(caxggxtcxatgtcxtgg)n，x可为任意碱基，标签基因相似度可为80%~100%。
27、其中，上述标签基因由核苷酸序列seq id no.1~seq id no.10任一序列所示。
28、本发明的有益效果：与传统热刺激诱导方式相比，本发明仅需提供诱导的瞬时温度，能够减少能量供应成本；诱导时间缩短，节约时间成本。
1.一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，所述目标温度tt为40~45℃。
3.根据权利要求1所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，所述n为1~11次。
4.根据权利要求1所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，所述诱导周期为1~2h。
5.根据权利要求1所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，上述每次加入热的lb液体培养基的体积vxn的具体确定方法为：先确定测定发酵培养液的温度tn、体积vn，取温度tn、体积vn的纯水，快速加入热水，使纯水温度达到目标温度tt后，记录使用的热水的体积，标记为vxn，vxn即为第n次需要加入的热的lb液体培养基。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，所述基因工程菌株shg13-s经脉冲式热刺激诱导后的应用步骤如下：将基因工程菌株shg13-s完成脉冲式热刺激诱导的发酵培养液继续培养2~3h，加入底物，使底物达到一定浓度，催化反应9~16h，获得目标产物，所述底物为含有邻苯基团的化合物。
7.根据权利要求1所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，基因工程菌株shg13-s的具体构建的过程，包括以下步骤：
8.根据权利要求1或7所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，所述阻遏基因tyrr、trpr、mtr、tnaa、arop的一处或多处。
9.根据权利要求1或7所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，所述标签基因序列可为重复序列，(caxggxtcxatgtcxtgg)n，x可为任意碱基，n可为不小于6的正整数，标签基因相似度可为80%~100%，所述标签基因由核苷酸序列seq id no.1~seq id no.10任一序列所示。
10.根据权利要求1或7所述的一种脉冲式热刺激诱导方式，其特征在于，所述目的基因为hpabc、quic、tpl的一种；所述hpabc的核苷酸序列由seq id no.11所示的hpab和seq idno.12的hpac组合而成；所述quic的核苷酸序列为seq id no.13所示；所述tpl的核苷酸序列为seq id no.14所示。