一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用

本发明属于植物病毒检测，具体涉及一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用。

背景技术：

1、柑橘相关弹状病毒(citrus-associated rhabdovirus,ciarv)首先在西番莲、柑橘和结香中被发现报道。该病毒主要通过嫁接、扦插等无性繁殖方式在柑橘以及西番莲中传播(尚未证实存在媒介昆虫)。目前研究结果显示，柑橘在感染ciarv后未表现明显症状，西番莲和结香则分别表现为黄斑以及褪绿黄斑等叶片症状。

2、ciarv为负链rna病毒，属弹状病毒科，细胞质弹状病毒属，其基因组结构与其他植物弹状病毒相似，包含五种典型的结构蛋白。通过比较了ciarv的基因组序列，最终在分类上将其归入番木瓜细胞质弹状病毒。

3、研究显示，植物弹状病毒具有感染多种草本和木本植物的能力，在感染植物后会对寄主植物造成一定损害，最终给农业生产带来巨大的经济损失。

4、柑橘和西番莲均是我国重要的经济作物。作为柑橘原产地之一，我国柑橘的产量和面积均居世界第一。近年来，我国的西番莲种植面积也随着国内外对西番莲的需求不断增长而扩大。随着柑橘与西番莲种植面积的扩大，病毒病发生、传播和扩散的风险也不断扩大。由于柑橘和西番莲在生产上常采用嫁接和扦插等方式育苗，因此该病毒也可能通过以上途径进行大范围或远距离传播。

5、目前对于ciarv的致病机制及其对柑橘以及西番莲的影响尚不明确，为了预防和控制病毒的发生与传播，建立相关病毒的快速检测方法，加强病毒的早期检测，对于及时制定有效的防治措施具有重要意义。

6、实时荧光定量pcr(real time quantitative pcr，rt-qpcr)是病毒检测中应用最广泛的技术之一，该方法快速、准确，且具有较高的检测灵敏度等优点。其灵敏度较普通rt-pcr高100倍，能对未知样品进行定量分析，为病毒的早期检测及防控预警提供相应的技术支撑。但该方法在ciarv病毒检测方面的应用，国内外至今尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为如何检测甜瓜内源病毒、或如何检测待测植物样本是否感染柑橘相关弹状病毒。为了解决上述技术问题，本发明依据ciarv的病毒rna依赖的rna聚合酶基因(rna-dependent rna polymerase,l)区域，设计了特异性扩增引物，可快速、精准、灵敏检测该病毒。

2、本发明第一方面，提供一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物，所述引物的序列如seq id no.1-2所示。

3、本发明第二方面，提供所述引物在如下a1或a2中的应用：

4、a1、检测柑橘相关弹状病毒；

5、a2、制备检测柑橘相关弹状病毒的制剂。

6、进一步的，a1是指：

7、检测待测植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒；或

8、检测待测病毒是否为柑橘相关弹状病毒。

9、本发明第三方面，提供一种检测植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒的方法，包括以下步骤：

10、b1、采用权利要求1所述的引物对所述植物材料的核酸进行pcr扩增；

11、b2、根据所述扩增的产物确定所述植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒。

12、进一步的，所述植物材料为柑橘或西番莲的叶片。

13、进一步的，所述核酸为所述植物材料的总rna。

14、进一步的，所述pcr为rt-qpcr。

15、更进一步的，所述rt-qpcr总体系为20μl：faststart essential dna greenmaster 10μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，模板cdna 1μl，rnase-free ddh2o 8μl补足体系至20μl。

16、更进一步的，所述rt-qpcr反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃退火10s，72℃延伸10s，45个循环。

17、进一步的，pcr结束后进行实时荧光定量检测，得到熔解曲线，熔解曲线分析在66℃-96℃，每升高0.5℃检测1次荧光信号，所得溶解曲线在81℃时为单一峰，说明植物材料感染柑橘相关弹状病毒，反之则没有感染或植物材料感染柑橘相关弹状病毒的浓度没有达到检测限。

18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

19、本发明首次提供了专用于ciarv病毒检测的实时荧光定量pcr检测方法。本发明选取的扩增靶序列是ciarv病毒编码的rna依赖的rna聚合酶蛋白(rna-dependent rnapolymerase,l)基因，本发明中采用的引物能够准确、灵敏、快速的检测柑橘相关弹状病毒。

技术特征：

1.一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物，其特征在于，所述引物的序列如seq idno.1-2所示。

2.权利要求1所述引物在如下a1或a2中的应用：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a1是指：

4.一种检测植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物材料为柑橘或西番莲的叶片。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸为所述植物材料的总rna。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr为rt-qpcr。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述rt-qpcr总体系为20μl：faststartessential dnagreen master 10μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，模板cdna 1μl，rnase-free ddh2o 8μl补足体系至20μl。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述rt-qpcr反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性10s,60℃退火10s，72℃延伸10s，45个循环。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，pcr结束后进行实时荧光定量检测，得到熔解曲线，熔解曲线分析在66℃-96℃，每升高0.5℃检测1次荧光信号，所得溶解曲线在81℃时为单一峰，说明植物材料感染柑橘相关弹状病毒，反之则没有感染或植物材料感染柑橘相关弹状病毒的浓度没有达到检测限。

技术总结
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用。本发明依据柑橘相关弹状病毒的病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因(RNA‑dependent RNA polymerase,L)区域，设计了特异性扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。该引物可快速、精准、灵敏检测柑橘相关弹状病毒。

技术研发人员：黄爱军,易龙,王莹,周俊,顾佩佩
受保护的技术使用者：赣南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15