一种提升酱油品质的方法

本发明涉及一种提升酱油品质的方法，属于酶工程及发酵工程。

背景技术：

1、l-谷氨酰胺酶(ec 3.5.1.2)催化l-谷氨酰胺水解为l-谷氨酸和氨，广泛分布于细菌、酵母和真菌等微生物中。这种酶在食品和医药方面有很大的应用潜力。反应产生的l-谷氨酸是负责食物新鲜味道的主要物质。酿造酱油中大约46％的谷氨酸是在酱油发酵过程中由l-谷氨酸产生的。然而，由于酱油中的高盐环境，曲霉菌中的l-谷氨酰胺酶活性受到抑制，这导致产生更多的无味的焦谷氨酰胺，而不是呈味物质谷氨酸。因此，必须挖掘耐盐的l-谷氨酰胺酶来提高酱油中的l-谷氨酸含量。喜马拉雅山脉uttarakhand的gangotri区分离出来的bacillus sp.lkg-01(mtcc 10401)的l-谷氨酰胺酶，在25％的盐浓度下，相对酶活性也很稳定)。来自micrococcus luteus k-3的l-谷氨酰胺酶在1.71m nacl存在下显示出最大的酶活性，而在3.08m nacl存在下，它显示出超过90％的活性。然而，酶的来源与食品安全有关，不符合食品安全标准的基因来源通常被认为是潜在的不安全。

技术实现思路

1、本发明提供了一种生产l-谷氨酰胺酶的重组枯草芽孢杆菌，表达了如seq idno.1所示的l-谷氨酰胺酶。

2、在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以质粒pma5为表达载体，表达seq idno.2所示的l-谷氨酰胺酶基因。

3、在一种实施方式中，所述l-谷氨酰胺酶基因上游15～20bp区域替换seq id no.3～10任一所示的rbs序列。

4、在一种实施方式中，所述l-谷氨酰胺酶基因上游20bp处的序列替换为seq idno.4所示的rbs序列。

5、本发明还提供了一种l-谷氨酰胺酶的固定化细胞。

6、在一种实施方式中，所述固定化细胞的制备方法为：

7、(1)培养所述重组枯草芽孢杆菌，收集细胞培养液中的菌体细胞；

8、(2)将步骤(1)收集的菌体细胞与海藻酸钠溶液混合，制备固定化细胞。

9、在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在发酵培养基中培养；所述发酵培养基含有蔗糖25g/l，酵母提取物40g/l，nh4cl 4g/l，kh2po4 1.125g/l，k2hpo4·3h2o 1.875g/l，cacl2 2g/l，l-谷氨酸钠2g/l。

10、在一种实施方式中，所述培养过程还进行了补料。

11、在一种实施方式中，用于补料的培养基含有：蔗糖，500g/l；k2hpo4，2.612g/l；kh2po4，2.041g/l；mgso4·7h2o，1.845g/l；nacl，5g/l。

12、本发明还提供了所述重组枯草芽孢杆菌或所述固定化细胞在酱油生产的中的应用。

13、在一种实施方式中，所述应用包括但不限于提高酱油中氨基酸的含量。

14、在一种实施方式中，所述氨基酸包括但不限于谷氨酸。

15、在一种实施方式中，所述应用是将所述重组枯草芽孢杆菌或所述固定化细胞加入至酱油发酵体系中。

16、在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以发酵粗酶液、全细胞或固定化细胞的形式添加至酱油发酵体系中。

17、在一种实施方式中，所述固定化细胞以500ml发酵液当量：1l酱油的比例添加至酱油发酵体系中。

18、有益效果：

19、(1)本发明通过表达耐盐、热稳定性提高的l-谷氨酰胺酶，并将酶在枯草芽孢杆菌中表达，构建了一株食品级重组枯草芽孢杆菌。

20、(2)本发明还通过优化5'-utr自由能和alra基因的合成生物学应用，提高了食品级重组菌株bsw3的酶活，使该菌株在5-l生物反应器中发酵可达到1535.24±20.83u/ml的产酶能力，这是迄今报道的最高产量。

21、(3)本发明构建的食品级重组菌株可作为全细胞催化剂用于酱油酿造过程中，可使酱油中的重要风味物质谷氨酸提高47％。

技术特征：

1.一种生产l-谷氨酰胺酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达了如seq id no.1所示的l-谷氨酰胺酶。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以质粒pma5为表达载体，表达seq id no.2所示的l-谷氨酰胺酶基因。

3.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述l-谷氨酰胺酶基因上游15～20bp区域替换为seq id no.3～10任一所示的rbs序列。

4.l-谷氨酰胺酶的固定化细胞，其特征在于，所述l-谷氨酰胺酶的氨基酸序列如seqid no.1所示。

5.一种制备权利要求4所述固定化细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)的培养过程中还进行了补料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用于补料的培养基含有：蔗糖、k2hpo4、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl。

8.权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求4所述的固定化细胞在酱油生产的中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括但不限于提高酱油中氨基酸的含量。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是将权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求4所述的固定化细胞加入至酱油发酵体系中。

技术总结
本发明公开了一种提升酱油品质的方法，属于酶工程及发酵工程技术领域。本发明将罗伊氏乳杆菌来源的耐盐谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中表达，并通过RBS序列调控，提高了耐盐谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达量，相比对照提高了5.61倍。本发明还通过对重组枯草芽孢杆菌固定化后，将固定化酶或固定化细胞投入到高盐稀态酱油酿造中，有效提升酱油的氨基酸态氮，从0.783±0.003g/100ml提高到0.841±0.002g/100ml，谷氨酸含量从5.0152±0.048g/l提高到7.319±0.068g/l，为酱油生产提供了一种高效且经济的方法。

技术研发人员：张显,饶志明,张恒维,徐美娟,杨套伟
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12