GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及ghkv3wrky29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用。

背景技术：

1、棉花是世界上重要的纤维作物和油料作物，在中国31个省份中就有过24个省种植棉花，其中有近3亿人参与其生产，30％的总播种面积用于棉花种植。其中，黄萎病(verticillium wilt)在生产上对棉花产量和纤维品质危害严重，由于黄萎病菌大丽轮枝菌(verticillium dahliae)危害棉花的维管束，导致化学药剂很难防治，现如今最有效的防治方法是培育和种植抗病品种。在过去的研究中，陆地棉抗黄萎病的相关基因研究进展缓慢，且抗黄萎病的主效基因还未见报道。由于黄萎病菌的易变性，导致过去培育的抗病品种抗病性丧失，不能持久，美国、澳大利亚等国家先后培育出acala、sicala 1等一系列抗病品种，但这些品种在我国只能达到耐病水平，kawchuk从番茄中已经克隆出了抗黄萎病基因ve，但发现其只能介导对大丽轮枝菌1号小种的抗性，其抗性具有特异性。目前，大多数研究都致力于发掘抗病基因。

2、wrky转录因子(wrky transcription factors)是一种植物特异性转录因子，具有防御损伤及防止病原菌入侵的作用，它是植物中所特有的。在其n端，wrky家族蛋白有一个能和dna结合的结构域，c末端既含有锌指结构，又含有高度保守的wrky结构域，以根据wrky结构域的数量和锌指结构的特征对wrky蛋白进行分类，即ⅰ、ⅱ、ⅲ三组。其中，ⅰ组为c2h2型(c-x4-5-c-x22-23-h-x1-h)，ⅱ组与ⅰ组相同，ⅲ组为c2hc型(c-x7-c-x23-h-x1-c)。在过去的研究中都发现，wrky转录因子是一个庞大的家族，在水稻中鉴定出102个wrky基因，它具有防御信号转递以及防止病菌入侵的作用。wrky转录因子在寄主防御上可正向和负向调节，过去的绝大多数研究都集中于wrk基因参与的正向抗病反应，wang等发现在拟南芥中atwrky53和atwrky70正向调节系统获得性抗性(systemic acquired resistance,sar)；deslandes等发现，atwrky52包括核苷酸结合-富含leu的重复类型r基因产物的结构特征和wrky结构域，该结构域对青枯病(ralstonia solanacearum)具有广泛的抗性；yang等发现wrky 1、wrky 3和wrky 5等11个wrky基因在马铃薯对晚疫病菌侵染的抵抗反应中具有积极的调节作用；但是，二十一世纪以来，许多研究者开始转向wrky-tf对病原菌侵染的负调节作用，grunewald等发现wrky23转录因子在线虫摄食位点建立的早期阶段表达，敲除wrky23可降低胞囊线虫(heterodera schachtii)的侵入；水稻oswrky76和oswrky45-1基因过表达植物表现出更高的敏感性，oswrky45-1的敲除植物，表现出对水稻白叶枯病(xanthomonasoryzae)的增强抗性；胡椒的cawrky58基因，定位于细胞核，感染青枯病菌(ralstoniasolanacearum)的辣椒植株中，过度表达cawrky58的烟草植株，表现出比野生型植物更严重的病害症状。通过病毒诱导基因沉默(vigs)沉默的cawrky58辣椒植株对强毒青枯病菌菌株fjc100301表现出增强的抗性，表明cawrky58在辣椒对青枯病菌侵染的抗性中充当负调节因子的转录激活剂。随着对wrky转录因子超家族的深入研究，越来越多的wrky基因被证明在多种植物中参与抗病反应。最近的一项研究表明，陆地棉中的一个ⅲ族wrky转录因子ghwrky70至少通过两种方式负调控大丽轮枝菌的侵染。而如何筛选更多的能够差异表达wrky转录因子，以为培育抗棉花黄萎病品种提供候选基因，以及为改善现有棉花抗黄萎病不佳的状况具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供ghkv3wrky29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，过表达该基因可以提高陆地棉抗黄萎病能力，沉默该基因降低了陆地棉抗黄萎病能力。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供ghkv3wrky29基因在提高或者降低植物抗大丽轮枝菌(verticilliumdahliae k.)黄萎病中的应用。

4、优选的是，过表达所述植物的所述ghkv3wrky29基因，提高所述植物对黄萎病的抗性；沉默所述植物的所述ghkv3wrky29基因，降低所述植物对黄萎病的抗性。

5、优选的是，所述ghkv3wrky29基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

6、本发明还提供所述ghkv3wrky29基因编码的蛋白在提高或者降低植物抗黄萎病中的应用。

7、优选的是，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

8、优选的是，所述出发植物包括大丽轮枝菌寄主植物。更优选的为，所述植物包括拟南芥和陆地棉。

9、本发明还提供一种获取对黄萎病抗性改变的转基因植物的方法，通过将ghkv3wrky29基因导入出发植物中过表达，得到对黄萎病抗性提高的转基因植物；或者通过沉默出发植物中ghkv3wrky29基因降低该基因的表达，得到对黄萎病抗性降低的转基因植物。

10、优选的是，所述ghkv3wrky29基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

11、优选的是，所述出发植物包括拟南芥和陆地棉。

12、优选的是，所述黄萎病为由大丽轮枝菌引起的黄萎病。

13、本发明公开了以下技术效果：

14、本发明根据陆地棉转录组测序结果，筛选得到的一个差异表达的ghkv3wrky29基因，其表达模式为上调表达，通过对该基因的克隆分析，以及应用病毒诱导的基因沉默(vigs)技术对该基因进行功能验证，证实了该基因在陆地棉抗黄萎病方面的作用。因此，该基因可为培育棉花等农作物抗黄萎病品种提供候选基因。

15、本发明还通过从棉花叶片中克隆获得陆地棉抗黄萎病的ghkv3wrky29基因，并通过实验过表达和沉默该基因评价了对黄萎病抗性的影响性，结果证实，过表达该基因具有提高抵抗黄萎病性的能力，沉默则可以降低高抗病棉花品种的抗黄萎病性。这为ghkv3wrky29应用到陆地棉和其他农作物的抗病育种提供了科学依据，可以将该基因利用分子生物学技术转入感病高产优质的农作物品种，提高其抵抗大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)黄萎病性能，培育抗病高产优质的农作物品种。

技术特征：

1.ghkv3wrky29基因在提高植物抗大丽轮枝菌(verticillium dahliae k.)黄萎病中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，过表达所述植物的所述ghkv3wrky29基因，提高所述植物对黄萎病的抗性；沉默所述植物的所述ghkv3wrky29基因，降低所述植物对黄萎病的抗性。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ghkv3wrky29基因的核苷酸序列如seqid no:1所示。

4.权利要求1-3任一项中所述ghkv3wrky29基因编码的蛋白在提高或者降低植物抗黄萎病中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

6.如权利要求1或权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥和陆地棉。

7.一种获取对黄萎病抗性改变的转基因植物的方法，其特征在于，通过将ghkv3wrky29基因导入出发植物中过表达，得到对黄萎病抗性提高的转基因植物；或者通过沉默出发植物中ghkv3wrky29基因，降低该基因的表达，得到对黄萎病抗性降低的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ghkv3wrky29基因的核苷酸序列如seqid no:1所示。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述出发植物包括大丽轮枝菌寄主植物。

10.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述黄萎病为由大丽轮枝菌引起的黄萎病。

技术总结
本发明公开了GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用，属于基因工程领域。GhKV3WRKY29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过从高抗黄萎病棉花品种中植棉KV3叶片中克隆获得抗黄萎病基因GhKV3WRKY29，通过VIGS沉默该基因，使陆地棉品种的抗大丽轮枝菌黄萎病的能力丧失，超表达则提高了拟南芥抗大丽轮枝菌黄萎病的性能。因此，GhKV3WRKY29基因可以作为遗传改良感黄萎病优质高产农作物品种提供抗病候选基因。

技术研发人员：简桂良,卢美光,任玉红,贺浪
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12