一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽及其制备方法和应用

本发明涉及一种抗炎、抑菌功能肽，尤其是涉及一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、鸭肝的营养价值较高，但由于其强烈的泥土或金属的特殊气味，除了极少量的直接食用鸭肝和加工食品的辅料外，大部分鸭肝都被加工成肥料或饲料，利用附加值低。生物活性肽是由共价键连接具有特定顺序的天然氨基酸形成线形、环形结构，并通过调控生物体的代谢功能发挥一定的生物学或生理作用。根据最新的biopep数据库的统计数据，已收录的4,442种生物活性肽，包括768种抗氧化肽，1,077种抗高血压肽，512种抗菌肽，但抗炎肽仅有41种（2022年4月更新）。因此，我们将目光转移至以鸭肝为蛋白来源开发含有天然抗炎和抗菌能力的生物活性肽。目前，国内外还没有公开关于鸭肝蛋白源抗炎抑菌功能肽及其制备方法的相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种活性高、特异性强的鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽及其制备方法和应用。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽，包括dltgippap（p1），elkptpegdl（p2），idvspdspdhy（p3），iyvdavinh（p4），ldsnldlkf（p5），lgehnidv（p6），lvypfpgpi（p7），qtnlvpypr（p8），slvypfpgpipn（p9）和viesppei（p10）中的至少一种肽。

3、上述鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽的制备方法，包括以下步骤：

4、（1）提取鸭肝蛋白；

5、（2）将鸭肝蛋白酶解制备得到含有抗炎和抗菌肽的酶解粗提物；

6、（3）将酶解粗提物通过sephadex g-15分离得到抗炎和抗菌肽分离物；

7、（4）将抗炎和抗菌肽分离物通过rp-hplc纯化得到鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽，经lc-ms/ms鉴定分别为dltgippap，elkptpegdl，idvspdspdhy，iyvdavinh，ldsnldlkf，lgehnidv，lvypfpgpi，qtnlvpypr，slvypfpgpipn和viesppei。

8、进一步，步骤（1）具体为：取鸭肝，去筋，切碎后加水按质量体积比1 g：6 ml的比例于匀浆机上充分匀浆，用1 mol/l氢氧化钠调ph至12，不断搅拌，于8000 rpm，4 ℃离心10min，取中间层，继续用盐酸调ph至5.5，不断搅拌，于8000 rpm，4 ℃离心10 min，取沉淀得到鸭肝蛋白，冻干后冷冻保存备用。

9、进一步，步骤（2）具体为：在底物质量分数5%的鸭肝蛋白悬液中按添加量5000 u/g加混合酶，于ph 7.5，温度50℃，磁力水浴锅中酶解4 h后，95℃加热15 min灭酶，终止水解，将ph调至4.5，然后于8000 rpm，4 ℃，离心10min，以去除未酶解的蛋白质，得到含有抗炎和抗菌肽的酶解粗提物，然后冷冻干燥，保存在-40 ℃冰箱。

10、进一步，所述的混合酶为碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按质量比2：1：2：2的比例混合而成。

11、进一步，步骤（3）具体为：将0.1g酶解粗提物溶于10ml蒸馏水中，然后用0.45 μm水相过滤膜过滤后，采用sephadex g-15葡聚糖凝胶柱分离，上样量为1.5 ml，超纯水以1 ml/min的流速洗脱，检测波长为220 nm，共得到4个吸收峰，收集第1个吸收峰得到抗炎和抗菌肽分离物。

12、进一步，步骤（4）具体将抗炎和抗菌肽分离物用蒸馏水配置成5 mg/ml的溶液，用0.22 μm超滤膜过滤并超声脱气后，使用rp-hplc进行纯化，流动相a为含0.1wt%三氟乙酸的水溶液，流动相b为含0.1wt%三氟乙酸的乙腈溶液，以线性梯度方式洗脱0～2 min，0～5%乙腈；2～30 mim，5%～25%乙腈；30～35 min，25%～40%乙腈；35～60 min，5%乙腈，上样量为100 μl，检测波长为214 nm，流速为1 ml/min，分离得到6个峰，收集第1个峰，冷冻干燥，经lc-ms/ms鉴定为dltgippap（p1），elkptpegdl（p2），idvspdspdhy（p3），iyvdavinh（p4），ldsnldlkf（p5），lgehnidv（p6），lvypfpgpi（p7），qtnlvpypr（p8），slvypfpgpipn（p9）和viesppei（p10）。

13、上述鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽在制备炎症因子gapdh、tnf-α、il-6、cox-2和/或nf-κb抑制剂方面的用途。

14、上述肽viesppei在制备结肠炎小鼠肠道菌群调节药物或者结肠炎治疗药物方面或者小鼠结肠内梭状芽孢杆菌抑制剂的用途。

15、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽及其制备方法和应用，利用多种酶水解鸭肝蛋白获得小分子活性肽，进一步纯化并鉴定鸭肝肽，得到了10种新的抗炎肽，通过体外合成、计算机模拟、分子对接确认肽的生物学功能，在raw 264.7细胞和c57bl/6j小鼠肠道内中探讨抗炎、抗菌肽的生物活性，并筛选出1种新的强效抗炎、抗菌肽，提供了其可替代非甾体抗炎药和糖皮质激素类药物的应用价值。不仅可以解决鸭肝副产物的高值化利用，增加经济效益，还解决了工业生产肽的得率低、特异性不强、质量不稳定等问题，提供了具有抗炎、抗菌功能的肽高效生产方法。

技术特征：

1.一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽，其特征在于包括dltgippap，elkptpegdl，idvspdspdhy，iyvdavinh，ldsnldlkf，lgehnidv，lvypfpgpi，qtnlvpypr，slvypfpgpipn和viesppei中的至少一种肽。

2.一种权利要求1所述的鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种鸭肝蛋白源抗炎、抗菌功能肽的制备方法，其特征在于步骤（1）具体为：取鸭肝，去筋，切碎后加水按质量体积比1 g：6 ml的比例于匀浆机上充分匀浆，用1 mol/l氢氧化钠调ph至12，不断搅拌，于8000 rpm，4 ℃离心10 min，取中间层，继续用盐酸调ph至5.5，不断搅拌，于8000 rpm，4 ℃离心10 min，取沉淀得到鸭肝蛋白，冻干后冷冻保存备用。

4.根据权利要求2所述的一种鸭肝蛋白源抗炎、抗菌功能肽的制备方法，其特征在于步骤（2）具体为：在底物质量分数5%的鸭肝蛋白悬液中按添加量5000 u/g加混合酶，于ph7.5，温度50℃，磁力水浴锅中酶解4 h后，95℃加热15 min灭酶，终止水解，将ph调至4.5，然后于8000 rpm，4 ℃，离心10min，得到含有抗炎和抗菌肽的酶解粗提物，然后冷冻干燥，保存在-40 ℃冰箱。

5.根据权利要求4所述的一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽的制备方法，其特征在于所述的混合酶为碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按质量比2：1：2：2的比例混合而成。

6.根据权利要求4所述的一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽的制备方法，其特征在于步骤（3）具体为：将0.1g酶解粗提物溶于10ml蒸馏水中，然后用0.45 μm水相过滤膜过滤后，采用sephadex g-15葡聚糖凝胶柱分离，上样量为1.5 ml，超纯水以1 ml/min的流速洗脱，检测波长为220 nm，共得到4个吸收峰，收集第1个吸收峰得到抗炎和抗菌肽分离物。

7.根据权利要求5所述的一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽的制备方法，其特征在于步骤（4）具体为将抗炎和抗菌肽分离物用蒸馏水配置成5 mg/ml的溶液，用0.22 μm超滤膜过滤并超声脱气后，使用rp-hplc进行纯化，流动相a为含0.1wt%三氟乙酸的水溶液，流动相b为含0.1wt%三氟乙酸的乙腈溶液，以线性梯度方式洗脱0～2 min，0～5%乙腈；2～30 mim，5%～25%乙腈；30～35 min，25%～40%乙腈；35～60 min，5%乙腈，上样量为100 μl，检测波长为214 nm，流速为1 ml/min，分离得到6个峰，收集第1个峰，冷冻干燥，经lc-ms/ms鉴定分别为dltgippap，elkptpegdl，idvspdspdhy，iyvdavinh，ldsnldlkf，lgehnidv，lvypfpgpi，qtnlvpypr，slvypfpgpipn和viesppei。

8.一种权利要求1中所述的鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽在制备炎症因子gapdh、tnf-α、il-6、cox-2 和/或nf-κb抑制剂方面的用途。

9.一种权利要求1中所述的肽viesppei在制备结肠炎小鼠肠道菌群调节药物或者结肠炎治疗药物方面或者小鼠结肠内梭状芽孢杆菌抑制剂的用途。

技术总结
本发明公开了一种鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽及其制备方法和应用，特点是包括DLTGIPPAP，ELKPTPEGDL，IDVSPDSPDHY，IYVDAVINH，LDSNLDLKF，LGEHNIDV，LVYPFPGPI，QTNLVPYPR，SLVYPFPGPIPN和VIESPPEI中的至少一种肽，其制备方法包括以下步骤：1）提取鸭肝蛋白；2）将鸭肝蛋白酶解制备得到含有抗炎和抗菌肽的酶解粗提物；3）将酶解粗提物通过Sephadex G‑15分离得到抗炎和抗菌肽分离物；4）通过RP‑HPLC纯化得到鸭肝蛋白源抗炎和抗菌功能肽，经LC‑MS/MS鉴定分别为抗炎和抗菌功能肽，优点是活性高、特异性强。

技术研发人员：潘道东,范贤康,孙杨赢,杜丽慧
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12