乙醇利用型大肠杆菌的适应性进化方法、大肠杆菌及其应用

本发明属于生物工程，具体地说，是关于一种乙醇利用型大肠杆菌的适应性进化方法、大肠杆菌及其应用。

背景技术：

1、乙醇的生产划分为生物法和化学合成法。生物法主要是微生物发酵法，通过微生物将底物转化为乙醇。化学合成的方法主要包括石油基来源的乙烯化学合成和co2的还原。目前，由于不可再生石油资源的缩减以及对纤维素原料的需求增加，使用可再生能源和一碳气体生产乙醇成为研究热点。目前，郎泽公司已实现微生物利用合成气工业化生产乙醇，但难以进一步延长碳链生产高附加值化学品。以乙醇为底物，通过构建工程化的工业微生物合成长链大宗化学品，能够整合一碳固定技术和工业微生物细胞工厂的各自优势，形成一碳固定-工业微生物偶联的催化体系，实现更高效的一碳气体为碳源的绿色生物制造模式。

2、目前大肠杆菌乙醇利用的工程菌株依赖于过表达乙醇利用途径如adhp-mhpf途径、ada-adh2途径以及adhe双功能酶突变体，在摇瓶以及工业应用中不但存在质粒稳定性的问题，还需要额外添加抗生素，进一步提高了化学品生产的成本。使用天然的大肠杆菌作为乙醇利用的底盘细胞，不仅能够克服质粒表达的缺点，更能额外引入产物合成途径和代谢工程调控质粒，为代谢工程研究者们留下调控的空间。

3、迄今为止，研究者们通过酶工程和进化工程对携带乙醇利用途径的质粒进行突变和实验室适应性进化，从而获得能够高效利用乙醇的大肠杆菌基因工程菌株，但通过进化工程实现野生型大肠杆菌以乙醇为碳源进行生长的研究未见报道。

4、面临全球能源问题和气候问题的挑战，生物学家们提出利用非粮食型底物生产大宗化学品的生物炼制策略。乙醇可通过单酶或双酶催化直接形成乙酰辅酶a。乙酰辅酶a作为中心代谢产物，是生产3-羟基丙酸、异丙醇、异戊二烯以及聚羟基脂肪酸等多种化学品的前体物质。3-羟基丙酸(3-hp)是一种三碳非手性有机酸，3-羟基丙酸与乳酸(2-羟基丙酸)互为同分异构体，位列2004年美国能源部(doe)提出的12种重要平台化合物的第四位。由于其优良的化学性质，3-羟基丙酸可以用于生产多种多样的化学衍生物，如丙烯酸、1,3-丙二醇、甲基丙烯酸盐、丙烯酰胺、丙二酸等。

技术实现思路

1、发明人在长期的研发过程中惊奇地发现，将野生型大肠杆菌接种至以乙醇为唯一碳源的基础盐培养基上，经过超长时间(上百小时)的培养后会出现菌体生长；并且，将长出的菌株进行传代后，生长速率得到了显著提升，可进一步用于利用乙醇生产下游产品。

2、因此，本发明的第一个方面，提供了一种乙醇利用型大肠杆菌的适应性进化方法，包括以下步骤：

3、s1：将野生型大肠杆菌接种至以乙醇为唯一碳源的基础盐培养基上，培养至菌体出现生长；

4、s2：将s1长出的菌体进一步接种至新鲜的以乙醇为唯一碳源的基础盐培养基上继续培养，选取生长速率较快的菌株；

5、其中，所述以乙醇为唯一碳源的基础盐培养基是在基础无机盐培养基中添加10g/l的乙醇。

6、根据本发明，所述基础无机盐培养基的配方如下：

7、na2hpo4·12h2o 15.1g/l，kh2po4 3.0g/l，nacl 0.5g/l，nh4cl 1.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，cacl2 0.011g/l，1％(m/v)的微量元素母液(te)0.1ml，1％(m/v)的维生素b10.2ml，ph 7.0。

8、根据本发明的优选实施例，所述野生型大肠杆菌选自：mg1655、dh5α、bw25113、bl21(de3)、以及w3110。

9、本发明的第二个方面，提供了根据上述的适应性进化方法获得的乙醇利用型大肠杆菌。

10、根据本发明，所述乙醇利用型大肠杆菌的乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶双功能编码基因adhe出现了单点突变。

11、进一步的，所述单点突变的突变位点为乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶双功能编码基因adhe的1747位的t突变为c，或者是1702位的g突变为a。

12、本发明的第三个方面，提供了一种生产3-羟基丙酸的乙醇利用型大肠杆菌，通过在上述的乙醇利用型大肠杆菌中构建丙酰辅酶a依赖的3-羟基丙酸合成途径而实现。

13、根据本发明，所述构建丙酰辅酶a依赖的3-羟基丙酸合成途径包括：

14、以ptrc99a质粒为载体，通过诱导型启动子trc表达来源于chloroflexusaurantiacus的丙二酰-coa还原酶编码基因mcr和corynebacterium glutamicum的乙酰-coa羧化酶编码基因dtsr1和accbc，构建重组质粒，然后转化上述的乙醇利用型大肠杆菌。

15、根据本发明，所述来源于chloroflexus aurantiacus的丙二酰-coa还原酶编码基因mcr的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述来源于corynebacterium glutamicum的乙酰-coa羧化酶编码基因dtsr1和accbc的序列分别如seq id no.2和3所示。

16、本发明的第四个方面，提供了上述的乙醇利用型大肠杆菌的应用，用于以乙醇为碳源生产3-羟基丙酸。

17、本发明具有以下有益效果：

18、1、本发明首次发现了乙醇利用型大肠杆菌的适应性进化方法，得到的大肠杆菌能够利用乙醇为碳源生长，并且对于多种大肠杆菌都有普遍的适用性。

19、2、本发明提供的乙醇利用型大肠杆菌，通过构建丙酰辅酶a依赖的3-羟基丙酸合成途径，可以利用乙醇生产3-羟基丙酸，为3-羟基丙酸的生产提供了一条新的途径，具有很好的应用前景；同时也为生产其它下游产品提供了新的思路。

技术特征：

1.一种乙醇利用型大肠杆菌的适应性进化方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的适应性进化方法，其特征在于，所述基本无机盐培养基的配方如下：

3.根据权利要求1所述的适应性进化方法，其特征在于，所述野生型大肠杆菌选自mg655、dh5α、bw25113、bl21(de3)、以及w3110。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的适应性进化方法获得的乙醇利用型大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述的乙醇利用型大肠杆菌，其特征在于，所述乙醇利用型大肠杆菌的乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶双功能编码基因adhe出现了单点突变。

6.根据权利要求5所述的乙醇利用型大肠杆菌，其特征在于，所述单点突变的突变位点为乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶双功能编码基因adhe的1747位的t突变为c，或者是1702位的g突变为a。

7.一种生产3-羟基丙酸的乙醇利用型大肠杆菌，其特征在于，通过在权利要求4-6中任一项所述的乙醇利用型大肠杆菌中构建丙酰辅酶a依赖的3-羟基丙酸合成途径而实现。

8.根据权利要求7所述的乙醇利用型大肠杆菌，其特征在于，所述构建丙酰辅酶a依赖的3-羟基丙酸合成途径包括：

9.根据权利要求8所述的乙醇利用型大肠杆菌，其特征在于，所述来源于chloroflexusaurantiacus的丙二酰-coa还原酶编码基因mcr的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述来源于corynebacterium glutamicum的乙酰-coa羧化酶编码基因dtsr1和accbc的序列分别如seq id no.2和3所示。

10.权利要求7-9中任一项所述的乙醇利用型大肠杆菌的应用，其特征在于，用于以乙醇为碳源生产3-羟基丙酸。

技术总结
本发明公开了一种乙醇利用型大肠杆菌的适应性进化方法，包括步骤S1：将野生型大肠杆菌接种至以乙醇为唯一碳源的基础盐培养基上，培养至菌体出现生长；和S2：将S1长出的菌体进一步接种至新鲜的以乙醇为唯一碳源的基础盐培养基上继续培养，选取生长速率较快的菌株；其中，所述以乙醇为唯一碳源的基础盐培养基是在基础无机盐培养基中添加10g/L的乙醇。本发明还公开了根据上述适应性进化方法获得的乙醇利用型大肠杆菌，以及一种生产3‑羟基丙酸的乙醇利用型大肠杆菌及其利用乙醇生成3‑羟基丙酸的应用。本发明首次发现了乙醇利用型大肠杆菌的适应性进化方法，得到的大肠杆菌能够利用乙醇为碳源生长，并且对于多种大肠杆菌都有普遍的适用性。

技术研发人员：吴辉,卢觉枫,王钰莹,罗远婵
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11