一种重组大肠杆菌催化合成前列腺素E2的方法与流程

本发明涉及化合物制备，尤其涉及一种重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法。

背景技术：

1、前列腺素e2(简称pge2)，对各期妊娠子宫均有收缩作用。在制备pge2的过程中，目前主要生产方法为利用羊精囊获得的相关酶的混悬液与花生四烯酸混合孵育，转化液经过一系列分离纯化干燥最终得到纯品pge2。

2、发明专利cn111394289a公开了一种重组大肠杆菌，其能够表达前列腺素h合成酶和前列腺素e2合成酶，可以用来生产pge2。

3、发明专利cn111394289a的实施例5中公开了重组大肠杆菌经发酵培养后，将菌体完全破碎后获得含前列腺素h合成酶和前列腺素e2合成酶的粗酶液，然后以花生四烯酸为底物在26℃搅拌通气反应4h得到反应液，催化合成前列腺素e2的方法，其反应液中前列腺素e2的产量为0.85g/l；但是此方法制得的前列腺素e2杂质较多，需要投入大量设备且工艺繁琐，不利于下游分离纯化工作。

技术实现思路

1、基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，本发明可以通过离心实现固液分离，减少最终反应液中的杂质，减少设备投入和工艺环节，提高产品纯度。

2、本发明提出了一种重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，包括如下两个方式：一是取冷冻成固体的重组大肠杆菌与缓冲盐溶液混匀溶解得到重组大肠杆菌缓冲液；将重组大肠杆菌缓冲液与花生四烯酸、谷胱甘肽、消泡剂混匀得到反应液，然后进行酶促反应，至前列腺素e2浓度不再增加时停止反应即可。二是在方式一反应液的基础上分别加入终浓度为0.2％(w/v)sds、0.2％(v/v)triton-100、50mg/l氯化十六烷基吡啶，然后进行酶促反应，至前列腺素e2浓度不再增加时停止反应即可。

3、优选地，重组大肠杆菌为能够表达前列腺素h合成酶和前列腺素e2合成酶的重组大肠杆菌。

4、上述重组大肠杆菌可以为发明专利cn111394289a中所述的重组大肠杆菌，如保藏编号为cgmcc no.19049的重组大肠杆菌bl21(de3)/pet28a-pghs-mpges1、保藏编号为cgmcc no.19050的重组大肠杆菌bl21(de3)/pet28a-pghs-mpges2中的至少一种。

5、上述重组大肠杆菌也可以为按照本领域常规基因过表达方法制备得到的能够表达前列腺素h合成酶和前列腺素e2合成酶的重组大肠杆菌；所述“本领域常规基因过表达方法”可以参照发明专利cn111394289a的实施例1-3中所述方法，也可以参照其他文献中的基因过表达方法。

6、优选地，所述重组大肠杆菌是经发酵培养后的重组大肠杆菌。

7、优选地，取冷冻成固体的重组大肠杆菌，经敲碎处理后，再与缓冲盐溶液混匀快速融化、溶解即可。

8、优选地，冷冻温度≤-20℃，冷冻时间≥24h。

9、优选地，酶促反应的温度为35-37℃，溶氧量≥50％。

10、上述溶氧量可以通过调节转速、通气量来达到所需溶氧量。

11、优选地，缓冲盐溶液为ph＝7.95-8.05的磷酸盐缓冲水溶液。

12、优选地，缓冲盐溶液中磷酸根离子的浓度为49-51mmol/l。

13、上述磷酸盐缓冲水溶液可以为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲盐溶液。

14、上述重组大肠杆菌缓冲液在配置过程中，重组大肠杆菌和缓冲盐溶液混合后，其ph可能会发生波动，可用氢氧化钠水溶液调节ph＝7.95-8.05。

15、优选地，重组大肠杆菌缓冲液中，重组大肠杆菌的浓度为120-130g/l。

16、优选地，反应液中，花生四烯酸的浓度为1.0-1.1g/l。

17、优选地，重组大肠杆菌、花生四烯酸的重量比为(120-130):(1-1.1)。

18、优选地，重组大肠杆菌、谷胱甘肽的重量比为(120-130):(0.745-0.755)。

19、优选地，谷胱甘肽、消泡剂的重量比为(0.745-0.755):(0.15-0.25)。

20、优选的，sds的工作浓度为0.2％(w/v)。

21、优选的，triton-100的工作浓度为0.2％(v/v)。

22、优选的，氯化烷基十六吡啶的工作浓度为50mg/l。

23、优选地，在进行酶促反应过程中，每隔0.5h检测反应液中前列腺素e2的浓度，至前列腺素e2浓度不再增加时停止反应。

24、上述消泡剂可以为高效硅聚醚复合型消泡剂，有机硅氧烷类消泡剂，聚醚类消泡剂，硅和醚接枝类消泡剂等。

25、上述水可以为去离子水、纯化水等。

26、有益效果：

27、本发明对发酵后的重组大肠杆菌进行冷冻成完全固态处理，敲碎后与缓冲盐溶液快速复溶、溶解，同时在不同表面活性剂sds、triton-100、氯化十六烷基吡啶存在条件下，使得大肠杆菌细胞膜通透性增加，花生四烯酸更容易进入细胞，然后在大肠杆菌胞内前列腺素h合成酶和前列腺素e2合成酶催化作用下快速生成pge2。且菌体本身在冷冻-快速复溶、溶解、透化过程中，并没有完全破碎；相较于将菌体完全破碎获得粗酶液，使用粗酶液制备pge2的方法，完整细胞结构为pge2合成提供更稳定的酶促环境，使反应更快速。并且可以减少最终反应液中的杂质，可以利用离心等简单的分离方法实现固液分离，减少萃取有机相里的杂质，而且可以减少设备投入、简化工艺环节，提高pge2纯度。

技术特征：

1.一种重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，包括如下步骤：取冷冻成固体的重组大肠杆菌与缓冲盐溶液混匀溶解得到重组大肠杆菌缓冲液；将重组大肠杆菌缓冲液与花生四烯酸、谷胱甘肽、消泡剂混匀得到反应液，然后进行酶促反应，至前列腺素e2浓度不再增加时停止反应即可。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，取冷冻成固体的重组大肠杆菌与缓冲盐溶液混匀溶解，然后向其中加入花生四烯酸、谷胱甘肽、消泡剂、表面活性剂，开始酶促，至前列腺素e2浓度不再增加时停止反应；优选地，所述表面活性剂选自sds、triton-100、氯化十六烷基吡啶中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，重组大肠杆菌为能够表达前列腺素h合成酶和前列腺素e2合成酶的重组大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，取冷冻成固体的重组大肠杆菌，经破碎处理后，再与缓冲盐溶液混匀溶解；优选地，冷冻温度≤-20℃，冷冻时间≥24h。

5.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，酶促反应的温度为35-37℃，溶氧量≥50％。

6.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，缓冲盐溶液为ph＝7.95-8.05的磷酸盐缓冲水溶液；优选地，缓冲盐溶液中磷酸根离子的浓度为49-51mmol/l。

7.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，重组大肠杆菌缓冲液中，重组大肠杆菌的浓度为120-130g/l。

8.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，反应液中，花生四烯酸的浓度为1.0-1.1g/l；优选地，重组大肠杆菌、花生四烯酸的重量比为(120-130):(1-1.1)。

9.根据权利要求1所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，重组大肠杆菌、谷胱甘肽的重量比为(120-130):(0.745-0.755)；优选地，谷胱甘肽、消泡剂的重量比为(0.745-0.755):(0.15-0.25)。

10.根据权利要求1-9任一项所述重组大肠杆菌催化合成前列腺素e2的方法，其特征在于，在进行酶促反应过程中，每隔0.5h检测反应液中前列腺素e2的浓度，至前列腺素e2浓度不再增加时停止反应。

技术总结
本发明公开了一种重组大肠杆菌催化合成前列腺素E<subgt;2</subgt;的方法，包括如下两个方案：取冷冻成固体的重组大肠杆菌与缓冲盐溶液混匀溶解得到重组大肠杆菌缓冲液；将重组大肠杆菌缓冲液与花生四烯酸、谷胱甘肽、消泡剂混匀得到反应液，然后进行酶促反应，至前列腺素E<subgt;2</subgt;浓度不再增加时停止反应即可。进一步地，可以在上述方案的基础上分别向酶促液里加入表面活性剂SDS、Triton‑100、氯化十六烷基吡啶，至前列腺素E<subgt;2</subgt;浓度不再增加停止反应。本发明可以为前列腺素E<subgt;2</subgt;合成提供更稳定的细胞内酶促环境，加快反应速率。

技术研发人员：王康林,汪晓东,安双双,孟小川
受保护的技术使用者：合肥康诺生物制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12