一种降解组测序的建库试剂盒、方法和应用与流程

本发明属于基因测序，具体地，涉及一种降解组测序的建库试剂盒、方法和应用。

背景技术：

1、micrornas(mirnas)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码rna，其大小长约18～25个核苷酸。成熟的mirnas是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进rna诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mrna，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mrna或者阻遏靶mrna的翻译。最近的研究表明mirna参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。

2、在植物体内绝大多数的mirna是利用剪切作用调控靶基因的表达，且剪切常发生在mirna与mrna互补区域的第十位核苷酸上。靶基因经剪切产生二个片段，5’剪切片段和3’剪切片段，其中3’剪切片段包含有自由的5’单磷酸基团和3’polya尾巴，可被rna连接酶催化，连接产物可用于下游高通量测序。而含有5’帽子结构的5’剪切片段或是其他缺少5’单磷酸基团的rna是无法被rna酶催化连接的，因而无法进入下游的测序实验。

3、随着下一代测序(next generation sequencing)或称高通量测序(high-throughput sequencing)的出现和发展，近来出现了一种新的实验方法称为降解组测序。降解组测序(degradome sequencing)是一种研究mirna靶标的新型高通量测序，其主要通过对mirna所结合并降解的信使rna(mrna)产物进行高通量测序，再用生物信息学方法筛选出mirna的靶基因，定位mirna对靶基因的降解位点。对测序数据进行深入地比对分析，可以直观地发现在mrna序列的某个位点会出现一个波峰，而该处正是候选的mirna剪切位点。

4、常见的构建降解组文库一般流程包括末端修复、5p接头连接、3p接头连接、反转录、pcr短扩增、酶切、dna接头连接和pcr扩增(german,m.a、nat protoc,4,356-362.)。然而，该方法实验操作繁琐，而且对样品量的要求也很高，难以满足科研和生产的需要。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题中的至少一种，本发明旨在提供一种降解组测序的建库方法，对文库构建步骤进一步优化，极大缩短了实验时间，也大幅降低了样本起始量要求，使更多样的样品能够进行降解组的分析，得到具有可靠的具有生物学意义的数据。为此，本发明的技术方案如下：

2、本发明第一方面提供一种降解组测序的建库试剂盒，包括5p接头和mi-rtp，其中，所述5p接头和mi-rtp分别具有seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列。

3、进一步地，所述建库试剂盒还包括逆转录试剂和/或pcr试剂。

4、在本发明的一些实施方案中，所述pcr试剂包括pcr引物，pcr上游引物具有seq idno.3所示的核苷酸序列，pcr下游引物具有seq id no.4或seq id no.5所示的核苷酸序列。在本发明的一些优选实施方案中，所述pcr下游引物选自seq id no.6～seq id no.29中的至少一种。

5、进一步地，所述建库试剂盒还包括纯化试剂。更进一步地，所述纯化试剂包括磁珠(beads)。

6、进一步地，所述建库试剂盒还包括mrna提取试剂。

7、本发明第二方面提供一种利用本发明第一方面所述的建库试剂盒进行建库的方法，包括以下步骤：

8、s1，获得mrna样本，添加所述5'接头；

9、s2，利用mi-rtp对添加所述5'接头后的rna进行逆转录，获得cdna样本；

10、s3，以步骤s2获得的cdna样本为模板进行pcr扩增；

11、s4，对pcr扩增产物进行纯化，得到文库。

12、在本发明的一些实施方案中，步骤s3中，pcr上游引物具有seq id no.3所示的核苷酸序列，pcr下游引物具有seq id no.4或seq id no.5所示的核苷酸序列。在本发明的一些优选实施方案中，所述pcr下游引物选自seq id no.6～seq id no.29中的至少一种。

13、在本发明的一些实施方案中，步骤s3中，pcr扩增的体系为：hot startflex 2×master mix 13μl；pcr上游引物1μl；pcr下游引物1μl；cdna 10μl。

14、在本发明的一些实施方案中，步骤s3中，pcr扩增的程序为：98℃30sec；98℃10sec，60℃30sec，72℃，15sec，15循环；72℃10min；4℃∞。

15、本发明的有益效果

16、相对于现有技术，本发明的有益效果是：

17、(1)利用本发明的建库试剂盒和方法进行建库，极大缩短了实验时间，也大幅降低了样本起始量要求，使更多样的样品能够进行降解组的分析，得到具有可靠的具有生物学意义的数据。

18、(2)利用本发明的试剂盒和方法进行降解组测序建库，实验流程简短快捷省时，起始样本量要求大幅降低；测序数据分析表明，本发明的测序数据比对率(unique mappedreads)更高，检测到的转录本种类(number of coverd transcript)更丰富，因而后续对于切割靶点的预测更为精准。

技术特征：

1.一种降解组测序的建库试剂盒，其特征在于，包括5p接头序列和mi-rtp，其中，所述5p接头序列和mi-rtp分别具有seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的建库试剂盒，其特征在于，还包括逆转录试剂和/或pcr试剂。

3.根据权利要求2所述的建库试剂盒，其特征在于，所述pcr试剂包括pcr引物，pcr上游引物具有seq id no.3所示的核苷酸序列，pcr下游引物具有seq id no.4或seq id no.5所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的建库试剂盒，其特征在于，还包括纯化试剂。

5.根据权利要求1-3任一所述的建库试剂盒，其特征在于，还包括mrna提取试剂。

6.一种利用权利要求1所述的建库试剂盒进行建库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s3中，pcr上游引物具有seq id no.3所示的核苷酸序列，pcr下游引物具有seq id no.4或seq id no.5所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s3中，pcr扩增的体系为：hotstart flex 2×master mix 13μl；pcr上游引物1μl；pcr下游引物1μl；cdna 10μl。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤s3中，pcr扩增的程序为：98℃30sec；98℃10sec，60℃30sec，72℃，15sec，15循环；72℃10min；4℃∞。

技术总结
本发明公开了一种降解组测序的建库试剂盒、方法和应用，属于基因测序技术领域。所述建库试剂盒包括5p接头序列和mi‑RTP，其中，所述5p接头序列和mi‑RTP分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。利用本发明的建库试剂盒和方法进行建库，极大缩短了实验时间，也大幅降低了样本起始量要求，使更多样的样品能够进行降解组的分析，得到具有可靠的具有生物学意义的数据。

技术研发人员：蔡霖霖,蒙先荣,刘鹤,王瑞
受保护的技术使用者：杭州联川生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13