一种广谱抗菌肽KTR及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种基于理性分子设计理念获得的新型广谱抗菌肽ktr及其应用。

背景技术：

1、目前，传统抗生素已在治疗细菌感染性疾病方面取得了显著效果，但由于人们对抗生素的滥用导致细菌耐药性逐渐增强，严重威胁人类的生命健康，因此越来越多的国家开始寻求绿色安全的抗生素替代物。因其抗菌活性高、抗菌范围广、分子量小、结构简单且不易产生耐药性等特性，天然抗菌肽已成为目前最具潜力的抗生素替代物之一。

2、天然抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的小分子活性多肽，同时也是机体防御细菌感染的主要物质之一。抗菌肽有两个共同的物理特征即阳离子性和疏水性，阳离子性可促进抗菌肽与带负电的细菌细胞膜之间的静电相互作用，可有效减弱其与哺乳动物细胞的结合能力，从而降低细胞毒性；疏水性则可促进抗菌肽与细菌细胞膜中脂质的相互作用，从而提高抗菌效果。与抗生素相比，抗菌肽具有广谱的抑菌活性以及独特的膜损伤或胞内杀菌机制。因此，研究抗菌肽对于开发新型抗生素代替药物具有十分重要的意义。

3、虽然天然抗菌肽具有许多优点，但其也存在某些明显的不足。许多天然抗菌肽的抑菌活性较低、稳定性较差、毒性较高，对哺乳动物体细胞溶血活性较高等，不能满足实际应用中的需求。因此针对上述问题，研究者通过对天然抗菌肽的物理化学参数(即净电荷，疏水性，两亲性等)进行改造，可有效改善天然抗菌肽的缺点，以适应不同应用场景的需要。因此，对现有天然抗菌肽进行修饰，以期获得抗菌活性更高、毒性更低的抗菌肽，已成为目前抗菌肽领域研究的热点之一。

技术实现思路

1、本发明针对上述天然抗菌肽存在的缺陷，提供一种基于氨基酸理性分子设计策略改造得到的广谱抗菌肽ktr及其应用。

2、为达到上述目的，本发明提供了一种广谱抗菌肽ktr，以鹰嘴豆球蛋白(legumin)源天然抗菌肽leg2为模板，通过氨基酸理性分子设计策略改造得到的新型广谱抗菌肽ktr，其氨基酸序列(如seq id no.1所示)为：arg-ile-lys-thr-arg-thr-trp-arg-leu-ala-leu-arg-trp-leu-lys-leu，用单字母表示为：riktrtwrlalrwlkl。

3、所述抗菌肽ktr以鹰嘴豆源天然抗菌肽leg2为模板，通过氨基酸理性分子设计理念改造制得。其中所述天然抗菌肽leg2的氨基酸序列为：arg-ile-lys-thr-val-thr-ser-phe-asp-leu-pro-ala-leu-arg-trp-leu-lys-leu，用单字母表示为：riktvtsfdlpalrwlkl，如(如seq id no.2所示)。

4、进一步的，上述新型广谱抗菌肽ktr，包括16个氨基酸残基，理论分子量为2110.63da，等电点为12.48，净电荷为+6，属于碱性抗菌肽。

5、本发明还提供了一种抗菌肽的抗菌应用，即所述新型广谱抗菌肽ktr在抑制多种革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌中的应用。

6、进一步的，上述新型广谱抗菌肽ktr表现出广谱且高效的抗菌活性，其对革兰氏阴性菌如大肠杆菌(atcc 35150)、大肠杆菌(atcc 8739)、鼠伤寒沙门氏菌(atcc 14028)、肺炎克雷伯菌(atcc 13883)和铜绿假单胞菌(atcc 10145)；对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌(atcc 25923)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(atcc 43300)等多种不同菌株均表现出优异的抗菌活性。

7、进一步的，所述广谱抗菌肽ktr在抑制革兰氏阴性菌的应用中，其对大肠杆菌(atcc 35150)、大肠杆菌(atcc 8739)、鼠伤寒沙门氏菌(atcc14028)、肺炎克雷伯菌(atcc13883)和铜绿假单胞菌(atcc 10145)的最小抑菌浓度分别为4.7μm、4.7μm、4.7μm、2.4μm和9.5μm。

8、进一步的，所述广谱抗菌肽ktr在抑制革兰氏阳性菌的应用中，其对金黄色葡萄球菌(atcc 25923)和甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(atcc43300)的最小抑菌浓度分别为9.5μm和7.1μm。

9、所述抗菌肽ktr在4.7～150.4μm浓度范围内，其对大鼠红细胞的溶血率<20％。

10、所述抗菌肽ktr在18.9～303.2μm浓度范围内，lo2和nih3t3的细胞存活率均>80％。

11、所述的广谱抗菌肽ktr在制备治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物中的应用。

12、本发明的技术优势在于：

13、一、本发明以鹰嘴豆源天然抗菌肽leg2为模板，通过氨基酸理性分子设计策略，成功构建出一条具有广谱抗菌活性的新型抗菌肽ktr，通过生物学参数预测其理化性质得知ktr主要为α-螺旋结构，理论分子量为2110.63da，等电点为12.48，净电荷为+6，本发明的提出对抗菌肽的设计和优化具有重要的指导意义。

14、二、本发明通过测定抗菌肽ktr的抗菌活性发现，与leg2相比，理性分子设计得到的新型抗菌肽ktr可显著提高对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等多种菌株的抑菌或杀菌效果。

15、三、本发明提供的新型抗菌肽ktr具有较低的溶血活性和细胞毒性。具体来说，在4.7～150.4μm浓度范围内，ktr对大鼠红细胞的溶血率<20％；在19.8～316.0μm浓度范围内，lo2和nih3t3的细胞存活率均>80％。因此，抗菌肽ktr可作为一种绿色安全的抗菌物质应用于食品、医药和农业生产等相关微生物控制领域中。

技术特征：

1.一种广谱抗菌肽ktr，其特征在于，所述广谱抗菌肽ktr的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的广谱抗菌肽ktr，其特征在于，所述抗菌肽ktr以鹰嘴豆源天然抗菌肽leg2为模板，通过氨基酸理性分子设计理念改造制得，其中，所述鹰嘴豆源天然抗菌肽leg2的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的广谱抗菌肽ktr在抑制革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌atcc35150、大肠杆菌atcc 8739、鼠伤寒沙门氏菌atcc 14028、肺炎克雷伯菌atcc 13883或/和铜绿假单胞菌atcc 10145。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌atcc25923或/和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌atcc 43300。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述广谱抗菌肽ktr对大肠杆菌atcc35150、大肠杆菌atcc 8739、鼠伤寒沙门氏菌atcc 14028、肺炎克雷伯菌atcc 13883和铜绿假单胞菌atcc 10145的最小抑菌浓度分别为4.7μm、4.7μm、4.7μm、2.4μm和9.5μm。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述广谱抗菌肽ktr对金黄色葡萄球菌atcc 25923和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌atcc 43300的最小抑菌浓度为9.5μm和7.1μm。

8.如权利要求1所述的广谱抗菌肽ktr在制备治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种新型广谱抗菌肽KTR及其应用，抗菌肽KTR，其氨基酸序列为RIKTRTWRLALRWLKL，包括16个氨基酸残基，理论分子量为2110.63Da，等电点为12.48，净电荷为+6，属于碱性抗菌肽。抑菌实验表明，抗菌肽KTR具有良好的广谱抗菌活性，其显著提高了对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制效果，MIC值为2.4～9.5μM。安全评价实验结果显示KTR具有较低的溶血活性，同时其对人源肝细胞LO2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的毒性较低。因此，本发明提供的抗菌肽KTR有望成为一种绿色安全的新型抗生素代替药物。

技术研发人员：郭鸣鸣,邹智鹏,何巧,钱梦嫣,刘东红,周建伟,徐恩波
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13