一种苗期鉴别柑橘果皮色泽的KASP分子标记及其应用

本发明涉及柑橘分子育种领域，更特别地，涉及一种苗期鉴别柑橘果皮色泽的kasp分子标记及其在柑橘育种中的应用。

背景技术：

1、柑橘作为世界上分布最广泛的果树之一，其色泽资源丰富，具有色泽多样性的特点。柑橘果皮色泽作为柑橘果实外观品质的重要评价指标之一，对消费者的购买喜好有着巨大的影响。因此，果皮色泽改良是柑橘高品质改良育种工作的重要内容之一。目前柑橘育种仍以常规杂交育种、芽变选种等育种途径为主，由于受到杂交育种周期长、育种成本高的限制，柑橘品质改良育种进程缓慢。

2、随着分子生物学技术的发展，以及大量表型连锁分子标记的开发，分子标记辅助选择技术在柑橘育种过程中得到了广泛应用。理论上，利用分子标记检测基因型，并根据待测柑橘的基因型鉴定或者辅助鉴定柑橘果皮色泽表型能够在苗期对杂交育种群体进行辅助选择，并通过早期筛选目标性状，从而有效地缩短育种周期、降低育种成本。然而，目前能够用于辅助鉴定柑橘果皮色泽的分子标记较少，大大增加了品质改良的育种成本。

3、kasp(kompetitive allele-specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)能够通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，实现高通量快速检测snp位点的目的。与ssr、rflp、indel等分子标记相比，kasp标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，kasp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐、低通量、价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发低成本、适合于高通量分子检测平台的柑橘果皮色泽表型鉴定的kasp分子标记，对于推广普及分子标记技术的应用、提高柑橘育种水平具有重要意义。

技术实现思路

1、本团队在研究过程中发现，kasp_chr6_96998位点为snp位点，该位点的基因型与柑橘的果皮色泽有着显著的相关性，因此可通过在育种群体苗期检测kasp_chr6_96998位点的基因型来预测柑橘果皮的色泽，辅助柑橘育种早期对目标性状进行筛选，大大缩短育种时间，降低育种成本。

2、基于以上发现，本发明提供了一种与柑橘果皮色泽连锁的snp位点，位于晚白柚参考基因组第6号染色体的第15696998位，所述位置的核苷酸类型为腺苷酸(a)或胸苷酸(t)。

3、在一个具体实施方案中，所述snp位点位于seq id no:1中第20位核苷酸。

4、本发明还提供了上述snp位点作为柑橘果皮色泽kasp分子标记的应用。

5、本发明还提供了一种用于辅助预测柑橘果皮色泽的试剂组，包括检测上述snp位点的核苷酸类型的试剂。

6、在一个具体实施方案中，所述试剂组包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物，所述第一正向引物的序列如seq id no:2所示，所述第二正向引物的序列如seq id no:4所示，所述反向引物的序列如seq id no:6所示。

7、在一个具体实施方案中，所述第一正向引物和所述第二正向引物的5’端分别标记了不同类型的荧光标记。

8、本发明还提供了一种辅助预测柑橘果皮色泽的方法，包括对上述snp位点进行检测，并根据检测结果辅助预测所述柑橘的果皮色泽的步骤。

9、在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：

10、s1：从所述柑橘的植株提取基因组dna；

11、s2：检测所述总dna中所述snp位点的核苷酸类型；

12、s3：根据所述snp位点的核苷酸类型辅助预测所述柑橘的果皮色泽。

13、在一个具体实施方案中，s2中使用第一正向引物、第二正向引物和反向引物，通过pcr检测所述snp位点的核苷酸类型，所述第一正向引物的序列如seq id no:2所示，所述第二正向引物的序列如seq id no:4所示，所述反向引物的序列如seq id no:6所示。

14、在一个具体实施方案中，所述第一正向引物和所述第二正向引物的5’端分别标记了不同类型的荧光标记。

15、本发明通过研究找到了一个与柑橘果皮色泽连锁的snp位点，根据该发现，利用开发的kasp分子标记，我们可以通过检测该snp位点的基因型来辅助预测柑橘果皮的颜色，为柑橘育种提供重要参考，以期在苗期对育种群体进行目标性状筛选，缩短育种周期，降低育种成本。

技术特征：

1.一种与柑橘果皮色泽连锁的snp位点，其特征在于，位于晚白柚参考基因组第6号染色体的第15696998位，所述位置的核苷酸类型为腺苷酸或胸苷酸。

2.根据权利要求1所述的snp位点，其特征在于，位于seq id no:1中第20位核苷酸。

3.权利要求1或2所述的snp位点作为柑橘果皮色泽kasp分子标记的应用。

4.一种用于辅助预测柑橘果皮色泽的试剂组，其特征在于，包括检测权利要求1或2所述的snp位点的核苷酸类型的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂组，其特征在于，包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物，所述第一正向引物的序列如seq id no:2所示，所述第二正向引物的序列如seq idno:4所示，所述反向引物的序列如seq id no:6所示。

6.根据权利要求5所述的试剂组，其特征在于，所述第一正向引物和所述第二正向引物的5’端分别标记了不同类型的荧光标记。

7.一种辅助预测柑橘果皮色泽的方法，其特征在于，包括对权利要求1或2所述的snp位点进行检测，并根据检测结果辅助预测所述柑橘的果皮色泽类型的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，s2中使用第一正向引物、第二正向引物和反向引物，通过pcr检测所述snp位点的核苷酸类型，所述第一正向引物的序列如seq idno:2所示，所述第二正向引物的序列如seq id no:4所示，所述反向引物的序列如seq idno:6所示。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一正向引物和所述第二正向引物的5’端分别标记了不同类型的荧光标记。

技术总结
本发明涉及一种苗期鉴别柑橘果皮色泽的KASP分子标记及其在柑橘育种中的应用。该标记的开发基于与柑橘果皮色泽连锁的SNP位点，位于晚白柚参考基因组第6号染色体的第15696998位，所述位置的核苷酸类型为腺苷酸或胸苷酸。根据本发明的技术方案和精神，我们可以通过在育种群体苗期检测该SNP位点基因型来辅助预测柑橘成熟期果皮色泽，进行目标性状早期筛选，为柑橘育种提供重要参考，降低育种成本。

技术研发人员：邓秀新,张颖梓,叶俊丽,晋佳净,李顺心
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12