一种具有改善骨质疏松、增强骨密度的多肽制备方法及应用

本发明涉及一种具有改善骨质疏松、增强骨密度的多肽制备方法及应用，属于生物活性肽领域。

背景技术：

1、骨质疏松症(osteoporosis，op)是一种全身性骨代谢紊乱的慢性疾病，主要表现为骨矿物含量降低、骨小梁结构稀疏、皮质骨变细、骨脆性增加等。随着人类寿命的延长、人口老龄化程度的增加，骨质疏松症的发病率逐年上升。与此同时，由于骨质疏松导致的骨折率也逐年升高，造成了严重的经济负担，已经成为严重的社会公众健康问题。骨质疏松的发生常常与年龄、饮食习惯、激素分泌、运动习惯以及遗传因素等多种因素有关。目前临床上用于治疗骨质疏松的药物主要有双磷酸盐、雌激素激活剂/抑制剂、甲状旁腺激素类似物和降钙素等，这些药物可以为患者减轻病痛，但同时也会常会伴随着过敏反应、胃肠道副反应及肝肾功能损害等副作用的发生。已有大量研究表明合理摄取一些含有调控骨生长功能的活性成分的食品能有效的预防骨质疏松的发生，也是医学治疗的有效辅助方式。

2、人体正常的骨稳态是由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收来共同维持的。成骨细胞负责新骨形成，而破骨细胞负责骨分解与吸收，二者共同作用维护骨组织不断重建过程。小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mc3t3-e1)能够特异性表达碱性磷酸酶(alp)和成骨相关转录因子runx-2等早期成骨分化表型标志物，目前已被广泛应用于成骨细胞分化的研究中。整合素(整联蛋白)由非共价连接的α和β异二聚体亚基组成，是跨膜粘附受体，介导细胞粘附依赖性和粘附细胞外基质以促进细胞增殖。研究表明含β1和αvβ的整联蛋白对于成骨细胞迁移、粘附、增殖和分化以及介导细胞与一些骨基质蛋白相互作用非常重要。某些肽和蛋白质可通过调节细胞信号的整合素来促进体内的骨形成过程。

3、越来越多的研究表明生物活性肽具有多种生物活性，能调节机体代谢，发挥多种功能，同时具有易消化吸收等特点在疾病的预防或治疗中发挥越来越大的作用。近年来，关于从不同食源性蛋白中寻找具有骨密度调节活性的多肽研究逐渐受到关注，罗非鱼胶原蛋白多肽、南极磷虾肽、狭鳕鱼皮胶原多肽、黄瓜籽多肽等物质均被报道有较好的调节骨密度活性，但由于技术的限制以及工艺成本高等因素，限制了其进行工业化生产和利用。鳕鱼(gadus morhua)作为全世界年捕捞量最大的鱼类之一，有较高的经济价值。其富含蛋白质及其种类丰富的氨基酸成分，具有较高的营养价值和药用价值。前期研究表明鳕鱼酶解物具有较强的骨密度调节活性，能有效缓减去卵巢小鼠骨质疏松症的发生。因此，以鳕鱼为原料，开发并鉴定出具有较强的骨密度调节的活性多肽对于骨质疏松保健食品和药品的开发具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明通过分离制备、分子对接并结合化学方法人工合成法提供了一种具有改善骨质疏松、增强骨密度的多肽制备方法，可应用于功能食品开发与生物制药等领域，调节骨密度或预防骨质疏松。

2、本发明提供了一种具有改善骨质疏松、增强骨密度的多肽p-gm-1，其氨基酸序列为met-asn-lys-lys-arg-glu-ala-glu-phe-gln(mnkkreaefq，如seq id no.1所示)，分子量为1280da。

3、本发明还提供了含有所述多肽的药物。

4、在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。

5、在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

6、在一种实施方式中，所述药物中多肽的纯度≥98％。

7、在一种实施方式中，所述多肽的作用剂量≥20mg/kg/天。

8、本发明还提供了所述多肽在制备缓解和/或治疗骨质疏松的药物中的应用。

9、在一种实施方式中，所述缓解和/或治疗骨质疏松包括：

10、(a)恢复因骨质疏松导致的骨密度降低；

11、(b)恢复因骨质疏松导致的骨量减少；

12、(c)恢复因骨质疏松导致的骨小梁数量减少。

13、本发明还提供了所述多肽在制备有助于改善骨密度的保健品中的应用。

14、本发明还提供所述多肽的制备方法，包括：

15、1)鳕鱼酶解液的制备；

16、2)根据多肽带电荷大小情况利用akta蛋白纯化仪和hitrap q-hp柱进行潜在骨密度调节活性肽的分离制备。

17、在一种实施方式中，所述多肽还可以通过化学合成的方法制备。

18、本发明还提供含有所述多肽的食品或药物，所述食品在制备时加入多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

19、有益效果：

20、1、本发明首次合成了该肽，是一种新型的具有改善骨质疏松症的活性肽，经检测具有较强的骨密度调节活性，能显著将骨质疏松小鼠的骨小梁数量从0.47 1/mm增加至0.73 1/mm，骨密度水平由0.42mg/cm3提升至0.46mg/cm3，并使股骨组织硬度提高40％，可应用于具有骨密度调节的功能性食品或药品的开发中；

21、2、该活性多肽来源于鳕鱼肌球蛋白重链，具有来源广、安全性高的特点，避免了目前采用骨质疏松治疗药物的明显副作用等问题，同时为骨质疏松症的预防提供了新的可能。

技术特征：

1.一种具有改善骨质疏松、增强骨密度功能的多肽，其特征在于，氨基酸序列如seq idno.1所示。

2.含有权利要求1所述多肽的药物。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物中多肽的纯度≥98％。

4.根据权利要求2或3所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

6.权利要求1所述的多肽在制备缓解和/或治疗骨质疏松的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述缓解和/或治疗骨质疏松包括(a)：～(c)至少一种作用：

8.权利要求1所述的多肽在制备有助于改善骨密度的保健品中的应用。

9.制备权利要求1所述多肽的方法，其特征在于，将目标多肽的c-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以c-端羧基所在的氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键；不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物；合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离。

10.含有权利要求1所述多肽的食品。

技术总结
本发明公开了一种具有改善骨质疏松、增强骨密度的多肽制备方法及应用，属于生物活性肽领域。所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(MNKKREAEFQ，P‑GM‑1)，分子量为1280Da，来源于鳕鱼肌球蛋白重链。所述多肽采用酶解、分离(根据电荷不同进行离子交换精细分离)、分子对接筛选及固相合成获得。在体内的去卵巢小鼠模型中，连续12周灌胃所述多肽能显著增加骨质疏松小鼠的骨小梁数量，提高骨密度水平。同时，去卵巢小鼠的骨组织硬度也提高40％。综上所述，本发明所述多肽来源广泛，制备方法简单，具有显著改善骨质疏松症的能力，可作为活性成分在骨密度调控相关的生物医药与食品保健等领域中应用。

技术研发人员：杜明,杨美莲,程述震,吴迪,王震宇,吴超,张彩芳,周婧琦
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12