A型肉毒素突变体及其基因工程菌的构建的制作方法

本发明属于生物，具体地，本发明涉及一种a型肉毒素突变体及其基因工程菌的构建，更具体地，本发明涉及一种a型肉毒素突变体、核酸分子、表达载体、基因工程菌、药物组合物及其用途。

背景技术：

1、肉毒素(botulinum neurotoxin，bont)是一种由厌氧肉毒梭状芽孢杆菌(简称“肉毒梭菌”)产生的神经毒素，是世界上已知毒性最强的物质之一，肉毒素分为7种类型的血清型(a型-g型)，其中最常见的为a型，称为a型肉毒素(botulinum neurotoxin of type a，bont/a)。

2、bont/a的结构分为两部分：轻链(lc，50kd)和重链(hc，100kd)，轻链和重链间靠一对链间二硫键链接(c430-c454)，非酰胺键链接。轻链为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性，是毒素的毒性部分。重链包含两个结构域，结合结构域和转位结构域，结合结构域负责与神经细胞膜上相应受体结合，并在内体膜上形成离子通道，转位结构域负责轻链的转位，将轻链移送至细胞内，轻链识别snap-25(一种突触囊泡相关蛋白)上的q197-r198位点，对其进行特异性切割。

3、多项研究表明，bont/a具有众多的应用场景，不仅在医学美容方面，在多种疾病的治疗方面也具有广泛的应用前景，随着在各种肌张力障碍、手足多汗症、疼痛以及其他多种疑难杂症等领域的临床应用，其疾病治疗范围在不断扩大。bont/a的治疗机理为，在神经肌肉接头处，bont/a与神经细胞表面的相应受体结合，借助其重链n端，跨膜将轻链移送至细胞内，通过切割snap-25来阻断乙酰胆碱的释放，引发肌肉持续的松弛性麻痹。

4、因此，亟需开发一种生物活性高的a型肉毒素。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种a型肉毒素突变体，该a型肉毒素突变体具有二硫键的错配率低和生物活性(毒力)高等优点。

2、本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

3、天然结构的活性bont/a分子由1296个氨基酸组成，分为轻链和重链，其中轻链含有448个氨基酸(1-448)，重链含有848个氨基酸(449-1296)，重链内形成一对二硫键(c1235-c1280)，位于重链的近c端区域，轻链与重链间形成一对二硫键(c430-c454)，构成该二硫键的半胱氨酸分别位于轻链的近c端及重链的近n端，依靠该二硫键，轻、重链间形成完整bont/a分子的正确架构，使得bont/a分子具有结合受体、跨膜转运、发挥毒力等生物学作用。

4、除了构成重链内二硫键(c1235-c1280)和轻链与重链间二硫键(c430-c454)的4个半胱氨酸之外，轻链和重链的一级结构组成中还存在其他游离的半胱氨酸，呈未配对状态。自然界肉毒梭菌产生a型肉毒素是一个缓慢的过程，形成天然结构的肉毒素分子作用力倾向使得自然界的a型肉毒素形成正确的高级构象，人工培养的肉毒梭菌或采用其他方式(如采用大肠杆菌表达)制备bont/a过程中，由于人为干预了肉毒梭菌的自然生长规律或其宿主菌体内bont/a的形成速率，使得部分细胞内bont/a不能形成与自然状态下一致的正确高级构象，从而影响bont/a的毒力。其原因除了由于分子间力(如氢键)的作用之外，游离半胱氨酸之间在空间上错配形成错配二硫键，也一定程度上改变了bont/a的空间结构构象，导致完整bont/a分子重链c端受体结合区、或重链n端转位区、或轻链酶活性区不再具有天然bont/a分子的各亚基结构的高级空间构象，降低或减弱bont/a分子的体内生物效应，甚至由于完整分子或亚基高级结构或空间构象的变化，人体应用后会产生针对这些非天然高级结构或空间构象的抗蛋白抗体(anti-protein antibody，简称apa)。

5、分子结构间氢键的形成与bont/a分子形成过程中的转录速率、翻译效率及宿主细胞内的环境状况密切相关，过快或不匹配的转录速率、翻译效率及不适合的宿主细胞内环境，很容易导致bont/a分子的结构不正确。分子的体内复性及组装过程中，游离半胱氨酸的存在，也容易导致半胱氨酸分子间二硫键的错配，这或者发生在天然结构位上游离的半胱氨酸之间，或者发生在天然结构位上游离的半胱氨酸与天然结构位上具有配对位的半胱氨酸之间，或者发生在天然结构位上具有不同配对位的半胱氨酸之间，无论何种情况的发生，都会一定程度上改变bont/a分子的高级构象，都会影响bont/a分子的体内生物效应，增加人体应用后产生针对这些“非天然”结构的apa，降低药效。

6、基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种a型肉毒素突变体。根据本发明的实施例，所述a型肉毒素突变体包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段和所述第二肽段通过链间二硫键相连；其中，所述第一肽段相较于野生型a型肉毒素的轻链，具有第134位和/或第165位的突变；和/或所述第二肽段相较于野生型a型肉毒素的重链，具有如下突变位点的至少之一：第791位、第967位和第1060位。发明人经过对天然bont/a分子的结构进行分析，并经过大量实验发现，对a型肉毒素的上述氨基酸进行突变可减少二硫键的错配，并提高其生物活性。

7、在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的a型肉毒素突变体中的第一肽段和/或第二肽段。根据本发明实施例的核酸分子可编码前述a型肉毒素突变体。

8、在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述的核酸分子。发明人经过实验发现，将上述表达载体导入至合适的宿主菌后，可在调控系统的介导下，有效实现a型肉毒素突变体的表达，以便大量获得a型肉毒素突变体。

9、在本发明的又一方面，本发明提出了一种基因工程菌。根据本发明的实施例，所述基因工程菌包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的a型肉毒素突变体。发明人经过实验发现，将上述基因工程菌置于合适条件下，可高效表达上述a型肉毒素突变体。

10、在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，包括前述的a型肉毒素突变体。本发明的药物组合物具有较高的生物活性(毒力)，不仅可用于医学美容，还可用于治疗或改善肌张力障碍、手足多汗症或疼痛等病症。

11、在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的a型肉毒素突变体或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于医学美容；或所述药物用于治疗或改善斜视、颈部肌张力障碍、喉肌肌张力障碍、上肢局灶性肌张力障碍、原发性手部震颤、流涎症、眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、脑卒中所致上/下肢痉挛、脑瘫所致的上/下肢痉挛、腋窝多汗症、手掌多汗症、逼尿肌-括约肌协同失调、慢性偏头痛及神经源性和特发性膀胱过度活动症中的至少之一。

12、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种a型肉毒素突变体，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的a型肉毒素突变体，其特征在于，所述链间二硫键通过所述第一肽链中的第430位半胱氨酸与所述第二肽链中的第454位半胱氨酸形成。

3.根据权利要求1所述的a型肉毒素突变体，其特征在于，所述第一肽段相较于野生型a型肉毒素的轻链，具有第134位和第165位的突变；和/或

4.根据权利要求1所述的a型肉毒素突变体，其特征在于，所述第134位、第165位、第791位、第967位或第1060位的半胱氨酸突变为如下氨基酸中的之一：

5.根据权利要求1所述的a型肉毒素突变体，其特征在于，所述第一肽段相较于野生型a型肉毒素的轻链，具有c134g和c165p的突变；

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～5任一项所述的a型肉毒素突变体中的第一肽段和/或第二肽段；

7.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求6所述的核酸分子；

8.一种基因工程菌，其特征在于，包括：

9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的a型肉毒素突变体；

10.权利要求1～5任一项所述的a型肉毒素突变体或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于医学美容；或

技术总结
本发明涉及一种A型肉毒素突变体。A型肉毒素突变体包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段和所述第二肽段通过链间二硫键相连；其中，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有第134位和/或第165位的突变；和/或所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有如下突变位点的至少之一：第791位、第967位和第1060位。本发明的A型肉毒素突变体具有二硫键的错配率低和生物活性高等优点。

技术研发人员：沈玉保,包国庆,郭力鸣
受保护的技术使用者：君合盟生物制药（杭州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12