一种高效降解2,4,6-三氯苯酚的菌株及其构建方法与流程

本发明属于生物工程，涉及一种高效降解2,4,6-三氯苯酚的菌株及其构建方法。

背景技术：

1、2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-tcp)是一种难溶于水、易溶于有机溶剂的氯代有机污染物，通常用于木材、纺织品以及皮革中作为防腐剂。tcp是一种被美国环境保护署(epa)列为优先污染物的有害物质。由于tcp自1950年代以来被用作木材、皮革和胶水防腐剂，因此tcp广泛存在于环境中。tcp通过饮用水、食物或受污染的空气被人体吸收，对人体产生毒害作用，例如咳嗽、慢性支气管炎、胸部喘息、肺功能改变和肺部病变等。动物研究表明，长期暴露于10,000μg/l tcp的环境下的小鼠诱发淋巴瘤和白血病。因此，发掘能够降解tcp的微生物对解决tcp带来的环境污染的问题至关重要。

2、钩虫贪铜菌(cupriavidus necator)jmp134是一种革兰氏阴性细菌，其基因组已被测序。它是从澳大利亚土壤中分离出来的，能够消耗tcp作为唯一的能源和碳源，c.necator jmp134中tcp降解途径已经被研究清楚。但是其降解tcp的能力还有待进一步加强。因此，通过代谢工程的手段对降解tcp的菌株进行改造，这将进一步有效地解决tcp带来的污染问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种高效降解2,4,6-三氯苯酚的菌株。

2、在第一方面，本发明提供一种高效降解2,4,6-三氯苯酚的菌株的构建方法，其是以钩虫贪铜菌jmp134(cupriavidus necator jmp134)为出发菌株，将tcp降解相关的基因(即，来源于格氏伯克霍尔德菌(caballeronia glathei)的tcpa基因、来源于约氏红球菌(rhodococcus jostii)的tcpc基因以及来源于小红白毛杯菌(lachnellulaoccidentalis)的tcpd基因)整合在紧邻phac基因之前，得到jmp134-1菌株；之后在jmp134-1菌株中过表达来源于其自身的pcai、pcaj和pcaf基因，进一步加强了菌株对2,4,6-三氯苯酚的降解能力，得到jmp134-2菌株。

3、tcp在钩虫贪铜菌jmp134中的降解途径如图1所示，该途径最终将2,4,6-tcp降解成乙酰-coa和琥珀酰-coa。

4、在一些实施方案中，上述方法中，所述tcpa基因的序列如seq id no:7中第1位至第1554位所示，其编码的3,5,6-三氯-2-吡啶醇单加氧酶的氨基酸序列如seq id no:8所示。

5、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述tcpc基因的序列如seq id no:7中第1568位至第2416位所示，其编码的6-氯羟基喹啉-1,2-双加氧酶的氨基酸序列如seqid no:9所示。

6、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述tcpd基因的序列如seq id no:7中第2430位至第3029位所示，其编码的马来酸还原酶的氨基酸序列如seq id no:10所示。

7、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述降解tcp的相关基因的整合是通过自杀型质粒介导的靶基因缺失策略实现。

8、自杀型质粒介导的靶基因缺失策略，重组主要由内源性reca依赖系统介导。基于sacb的反选择方法。sacb基因编码左旋蔗糖酶，能够水解蔗糖释放葡萄糖，并合成果聚糖。由于果聚糖能够在革兰氏阴性菌的周质中积累，会导致细胞裂解，因此果聚糖对许多细菌具有高毒性。细菌通过抗性筛选发生了第一次单交换之后，被置于含有高浓度蔗糖的反向选择培养基上。在此条件下，发生一次单交换的突变体表达了sacb基因之后，只有恢复到野生型或目标突变体的细胞才能生长，此时便可以通过pcr来区分野生型和目标突变体。

9、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，含有所述tcpa基因、tcpc基因和tcpd基因的tcpa-tcpc-tcpd片段通过自杀型质粒介导的靶基因缺失策略整合到钩虫贪铜菌jmp134基因组上，得到jmp134-1菌株，具体可以是：将seq id no:15所示的tcpa-tcpc-tcpd-phacdonor片段和自杀型pk19mobsacb质粒连接得到pk19-tcpa-tcpc-tcpd-phacdonor质粒，再将pk19-tcpa-tcpc-tcpd-phacdonor质粒通过接合的方式转入钩虫贪铜菌jmp134，通过同源单交换和同源重组筛选得到将tcpa基因、tcpc基因以及tcpd基因整合在钩虫贪铜菌jmp134基因组上插入到紧邻原有的phac基因之前的菌株，即jmp134-1菌株。

10、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述pcai基因的序列如seq id no:26中第1位至第570位所示，其编码的3-氧代己二酸辅酶a转移酶的氨基酸序列如seq idno:27所示。

11、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述pacj基因的序列如seq id no:26中第584位至第1222位所示，其编码的辅酶a转移酶的氨基酸序列如seq id no:28所示。

12、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述pacf基因的序列如seq id no:26中第1236位至第2438位所示，其编码的3-氧代己二酰辅酶a硫解酶的氨基酸序列如seqid no:29所示。

13、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述pcai、pacj和pacf基因由pj5启动子启动，其序列如seq id no:30所示。

14、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述在jmp134-1菌株中过表达来源于其自身的pcai基因、pcaj基因和pcaf基因是通过将含有这些基因的重组质粒转入jmp134-1菌株中实现的，所述重组质粒可以是pbbr1-pcai-pcaj-pcaf质粒，可以通过如下方法构建：

15、将seq id no:26所示的pcai-pcaj-pcaf片段插入pbbrmsc1质粒的xbaⅰ位点得到。

16、在第二个方面，本发明提供由上述任一所述的方法构建得到的菌株。

17、在第三个方面，本发明提供上述菌株在降解2,4,6-三氯苯酚中的应用。

18、与出发菌株jmp134相比，改造后的工程菌株jmp134-2，在含有2,4,6-三氯苯酚作为唯一碳源的mm培养基上od600可以达到0.63，提高了1.625倍，并且2,4,6-tcp的降解能力是其2.19倍。

技术特征：

1.一种降解2,4,6-三氯苯酚的菌株的构建方法，其是以钩虫贪铜菌jmp134(cupriavidus necator jmp134)为出发菌株，将来源于格氏伯克霍尔德菌(caballeroniaglathei)的tcpa基因、来源于约氏红球菌(rhodococcus jostii)的tcpc基因以及来源于小红白毛杯菌(lachnellula occidentalis)的tcpd基因，整合在phac基因之前，得到jmp134-1菌株；在jmp134-1菌株中过表达来源于其自身的pcai基因、pcaj基因和pcaf基因，得到jmp134-2菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述tcpa基因的序列如seq id no:7中第1位至第1554位所示，其编码的3,5,6-三氯-2-吡啶醇单加氧酶的氨基酸序列如seq id no:8所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述tcpc基因的序列如seq id no:7中第1568位至第2416位所示，其编码的6-氯羟基喹啉-1,2-双加氧酶的氨基酸序列如seq idno:9所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述tcpd基因的序列如seq idno:7中第2430位至第3029位所示，其编码的马来酸还原酶的氨基酸序列如seq id no:10所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述pcai基因的序列如seq idno:26中第1位至第570位所示，其编码的3-氧代己二酸辅酶a转移酶的氨基酸序列如seq idno:27所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述pacj基因的序列如seq idno:26中第584位至第1222位所示，其编码的辅酶a转移酶的氨基酸序列如seq id no:28所示。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述pacf基因的序列如seq idno:26中第1236位至第2438位所示，其编码的3-氧代己二酰辅酶a硫解酶的氨基酸序列如seq id no:29所示。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述tcpa基因、tcpc基因和tcpd基因的整合通过自杀型质粒介导的靶基因缺失策略实现。

9.由权利要求1-8任一项所述的方法构建得到的菌株。

10.权利要求9所述的菌株在降解2,4,6-三氯苯酚中的应用。

技术总结
本发明公开了一种高效降解2,4,6‑三氯苯酚的菌株及其构建方法。本发明公开的菌株是是以钩虫贪铜菌JMP134(Cupriavidus necator JMP134)为出发菌株，将外源TcpA基因、TcpC基因以及TcpD基因整合在phaC基因之前，得到JMP134‑1菌株；在JMP134‑1菌株中过表达来源于其自身的PcaI基因、PcaJ基因和PcaF基因，得到JMP134‑2菌株。与出发菌株JMP134相比，改造后的工程菌株JMP134‑2，在含有2,4,6‑三氯苯酚作为唯一碳源的MM培养基上OD600可以达到0.63，提高了1.625倍，并且2,4,6‑TCP的降解能力是其2.19倍。

技术研发人员：王嘉,王竞辉,岑祥许
受保护的技术使用者：万华化学（四川）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21