一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法。

背景技术：

1、去甲肾上腺素(norepinephrine或noradrenaline，缩写ne或na)即1-(3，4-二羟苯基)-2-氨基乙醇，属于儿茶酚胺类化合物，是一种主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素神经末梢合成并分泌的神经递质，也是一种激素。去甲肾上腺素可通过影响信号传导、相关脑能量代谢(如脑灌注、脑氧合、葡萄糖和乳酸的利用)、调节神经炎症等多种途径来影响组成脑细胞的神经元和神经胶质细胞进而影响脑功能。去甲肾上腺素不仅可用作药物中间体，并且其本身就是用于抢救急性低血压和周围血管扩张导致休克的一种药物。

2、去甲肾上腺素一般都是通过化学合成制备，比如cn108069863a公开了一种合成去甲肾上腺素的方法，以(-)-二异松蒎基氯硼烷为催化剂，在醚类溶剂中于低温下利用还原剂，将去甲肾上腺素酮直接还原生成左旋去甲肾上腺素，得到含有去甲肾上腺素的溶液。cn113717060a公开的技术方案用3，4-二羟基-2′-氯苯乙酮或3，4-二羟基-2′-溴苯乙酮为原料，在极性非质子溶剂中与手性化合物反应后，经还原剂还原、催化氢化反应获得去甲肾上腺素。

3、与化学合成相比，微生物转化法环境友好，过程无需高压催化剂等，污染小且产物得率高。cn112961873a公开了一种双酶耦合法合成去甲肾上腺素的方法，该技术方案以大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株，在胞内分别过表达了来源于哺乳动物的l-苏氨酸醛缩酶(s-ta)基因和短乳杆菌中编码酪氨酸脱羧酶(tdc)基因，获得两株工程菌，将细胞破碎得到的粗酶液添加3，4-二羟基苯甲醛为底物，甘氨酸为辅底物，添加5-磷酸吡哆醛为辅因子进行反应后获得酶法转化的去甲肾上腺素。以上方法仍然存在步骤过程相对复杂的问题。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法，以重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有底物多巴胺的反应体系中反应，将多巴胺一步转化为去甲肾上腺素，该重组大肠杆菌表达来源于人、家牛、鸡或玉米的多巴胺β-羟化酶或来源于黑腹果蝇的酪胺β-羟化酶，该多巴胺β-羟化酶的核苷酸序列如seq id no.01、02、03或04所示，该酪胺β-羟化酶的核苷酸序列如seq id no.05所示。

4、在本发明的一个优选实施方案中，所述多巴胺β-羟化酶来源于人，其氨基酸序列如seq id no.01所示。

5、在本发明的一个优选实施方案中，所述重组大肠杆菌以ptrc99a为表达载体。

6、在本发明的一个优选实施方案中，所述重组大肠杆菌的底盘细胞为e.colimg1655或e.coli bw25113。

7、在本发明的一个优选实施方案中，所述多巴胺在所述反应体系中的浓度为2.5-3.4g/100ml，该反应体系的溶剂为0.1m且ph＝6.5的tris缓冲液。

8、进一步优选的，所述反应的条件为：保持溶氧量0.8-1.04mm，30℃ 220rpm摇床中反应2-3h。

9、一种催化制备去甲肾上腺素的重组大肠杆菌，其以ptrc99a为表达载体，以e.colimg1655或e.coli bw25113为底盘细胞，携带多巴胺β-羟化酶或酪胺β-羟化酶，该多巴胺β-羟化酶的核苷酸序列如seq id no.01、02、03或04所示，该酪胺β-羟化酶的氨基酸序列如seq id no.05所示。

10、在本发明的一个优选实施方案中，其携带核苷酸序列如seq id no.01所示的多巴胺β-羟化酶。

11、上述重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

12、(1)将所述多巴胺β-羟化酶或酪胺β-羟化酶的基因与ptrc99a按照3∶1的摩尔比混合构建重组质粒；

13、(2)将重组质粒转化至所述底盘细胞中，即得所述重组大肠杆菌。

14、上述重组大肠杆菌在制备去甲肾上腺素中的应用。

15、本发明的有益效果是：本发明利用生物转化合成的策略，在大肠杆菌胞内构建外源去甲肾上腺素(norepinephrine)的生物合成途径，以大肠杆菌作为底盘细胞，构建表达外源多巴胺β-羟化酶(dopamine β-hydroxylase)的重组细胞，以多巴胺(dopamine)为底物，可以一步转化为目的产物去甲肾上腺素。

技术特征：

1.一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法，其特征在于：以重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有底物多巴胺的反应体系中反应，将多巴胺一步转化为去甲肾上腺素，该重组大肠杆菌表达来源于人、家牛、鸡或玉米的多巴胺β-羟化酶或来源于黑腹果蝇的酪胺β-羟化酶，该多巴胺β-羟化酶的核苷酸序列如seq id no.01、02、03或04所示，该酪胺β-羟化酶的核苷酸序列如seq id no.05所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多巴胺β-羟化酶来源于人，其氨基酸序列如seq id no.01所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌以ptrc99a为表达载体。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌的底盘细胞为e.colimg1655或e.coli bw25113。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多巴胺在所述反应体系中的浓度为2.5-3.4g/100ml，该反应体系的溶剂为0.1m且ph＝6.5的tris缓冲液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述反应的条件为：保持溶氧量0.8-1.04mm，30℃220rpm摇床中反应2-3h。

7.一种催化制备去甲肾上腺素的重组大肠杆菌，其特征在于：其以ptrc99a为表达载体，以e.coli mg1655或e.coli bw25113为底盘细胞，携带多巴胺β-羟化酶或酪胺β-羟化酶，该多巴胺β-羟化酶的核苷酸序列如seq id no.01、02、03或04所示，该酪胺β-羟化酶的氨基酸序列如seq id no.05所示。

8.如权利要求7所述的重组大肠杆菌，其特征在于：其携带核苷酸序列如seq id no.01所示的多巴胺β-羟化酶。

9.权利要求7或8所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

10.权利要求7或8所述的重组大肠杆菌在制备去甲肾上腺素中的应用。

技术总结
本发明公开了一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法，利用生物转化合成的策略，在大肠杆菌胞内构建外源去甲肾上腺素的生物合成途径，以大肠杆菌作为底盘细胞，构建表达外源多巴胺β‑羟化酶的重组细胞，以多巴胺为底物，可以一步转化为目的产物去甲肾上腺素。

技术研发人员：祁峰,黄建忠,阚乃鹏,李清晨,苏愉
受保护的技术使用者：福建师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16