一种快速致弱猪流行性腹泻病毒变异毒株的方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株、快速致弱猪流行性腹泻病毒变异毒株的方法及该毒株的应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)主要侵害1周龄内仔猪，造成感染仔猪呕吐、腹泻、继而脱水和急性死亡。针对该病原的疫苗产品，包括灭活疫苗和弱毒活疫苗，其中，灭活疫苗的使用仅限定于已经出现过感染的母猪，而弱毒活疫苗则不受此限制，是预防ped的首选。

2、目前，针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)致弱的方式有很多，包括在细胞上的持续传代、物理刺激(冷、热、紫外等)条件下的传代筛选、反向遗传系统改造等，这些方法都能够实现病毒致病力的弱化，但是同时也有各自的缺陷：持续传代需要的时间长，一般最少100代以上，甚至200代以上，由于传代时间长，往往导致pedv主要抗原基因s的巨大突变，此种方式得到的病毒尽管毒力致弱，但免疫原性不能得到保证；物理刺激的传代方式对于条件较难把握，细胞本身的生长容易受到抑制，因此要想稳定地实现细胞传代也不容易；反向遗传改造的方式最快，但由于pedv基因组较大，能够熟练掌握该技术的试验者极少，同时，pedv致病相关的基因研究较少，其基因改造的研究基础不够。

3、申请公布号为cn 105821006 a的发明专利申请，公开了变异猪流行性腹泻病毒弱毒yn150株，yn150株是由毒株yn144在10μg/ml胰酶的条件下在vero细胞上连续传6代得到的。虽然其在vero细胞上仅连续传代6代即得到了猪流行性腹泻病毒弱毒株，但是其是采用毒株yn144进行传代的，毒株yn144是将分离到的变异猪流行性腹泻病毒在vero细胞上连续传代120代，然后通过克隆纯化继续在vero细胞上传代至144代后得到的。该发明专利申请中猪流行性腹泻病毒弱毒株的传代时间仍然很长。

4、近几年的pedv遗传进化研究发现，该病毒已经出现了较高的基因多样性，因此，寻找一种能够快速、易行的pedv致弱方法，对于研制针对不同类型的pedv弱毒疫苗是有积极意义的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种实现猪流行性腹泻病毒快速传代致弱的方法、采用该方法致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株。该毒株以变异毒株猪流行性腹泻病毒变异毒henay16传代致弱而来，利用该毒株制备的弱毒活疫苗能够预防新生仔猪由于pedv感染引起的腹泻以及死亡，大大提高新生仔猪的存活率。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明利用caco2细胞对猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16进行传代，传代过程不需要要添加胰酶，最快30代即可得到致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株。与猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16相比，该致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株e蛋白编码基因缺失了attataagcatt，致弱毒株的s蛋白的氨基酸序列与seq id no:1所示的序列相比有99.6％的同源性，致弱毒株的sa蛋白的氨基酸序列与seq id no:2所示的序列相比有99.5％的同源性。seq id no:1为猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16的s蛋白的氨基酸序列，seq id no:2为猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16的sa蛋白的氨基酸序列。

4、优选的致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株，为传代30代后得到的一株致弱变异病毒，命名为henay16-r，并将该致弱毒株进行保藏，保藏编号为cgmcc no.20450；保藏时间是2021年4月27日；保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

5、上述的传代方法具体为：采用caco2细胞，待细胞生长覆盖率达90％时，按照感染复数0.01～0.1接种猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16，37℃吸附1h后弃去上清，加入维持液(含2％fbs的1×dmem培养基)，37℃培养，72h收获，于-70℃和室温反复冻融三次，10000×g离心10分钟，去掉细胞碎片，取上清冻存于-70℃，以此往后进行传代。

6、本发明将上述致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16-r在实验室及临床上进行了效果验证，结果显示，致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16-r具有很好的安全性，对1日龄不吃初乳仔猪不具有明显的致病性。

7、本发明的有益效果为：

8、本发明提供的一种猪流行性腹泻病毒快速传代致弱的方法以caco2细胞传代，传代过程不需要要添加胰酶，利用该方法可实现最快30代对猪流行性腹泻病毒快速的传代致弱。

9、以该方法传代得到的致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16-r的e蛋白编码基因出现了12个碱基的缺失(attataagcatt)，具有独特的标记，同亲本毒株比，致弱毒株的s蛋白仅有6个氨基酸的突变，主要抗原决定区sa蛋白仅有2个氨基酸的突变，保持了良好的免疫原性。

10、该致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16-r具有很好的安全性，对1日龄不吃初乳仔猪不具有明显的致病性，效力试验证明，该致弱毒株可有效预防由猪流行性腹泻病毒感染所造成的新生仔猪的腹泻以及死亡，大大提高新生仔猪的存活率，减少养殖业的损失。

技术特征：

1.致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，该致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株e蛋白编码基因缺失attataagcatt，s蛋白的氨基酸序列与seq id no:1所示的序列相比有99.6%的同源性，sa蛋白的氨基酸序列与seq id no:2所示的序列相比有99.5%的同源性。

2.根据权利要求1所述的致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，该致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株的保藏编号为cgmcc no.20450。

3.一种快速致弱猪流行性腹泻病毒变异毒株的方法，其特征在于，采用caco2细胞，对猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16传代不超过50代实现致弱，在传代过程中不添加胰酶。

4.根据权利要求3所示的一种快速致弱猪流行性腹泻病毒变异毒株的方法，其特征在于，采用caco2细胞，待细胞生长覆盖率达90%时，按照感染复数0.01～0.1接种猪流行性腹泻病毒变异毒株henay16，37℃吸附1h后弃去上清，加入维持液，37℃培养，72h收获，于-70℃和室温反复冻融三次，10000×g离心10分钟，去掉细胞碎片，取上清冻存于-70℃，以此往后进行传代。

5.根据权利要求4所示的一种快速致弱猪流行性腹泻病毒变异毒株的方法，其特征在于，所述维持液为含2% fbs的1×dmem培养基。

6.根据权利要求4所示的一种快速致弱猪流行性腹泻病毒变异毒株的方法，其特征在于，传代过程中，第1～10代的感染复数为0.1，10代以后的感染复数为0.01。

7.权利要求1或2所述的一株致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株在制备弱毒活疫苗中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株、快速致弱猪流行性腹泻病毒变异毒株的方法及该毒株的应用。该致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株E蛋白编码基因缺失了ATTATAAGCATT，S蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的序列相比有99.6%的同源性，SA蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的序列相比有99.5%的同源性。该方法采用CaCO2细胞，对猪流行性腹泻病毒变异毒株HeNAY16传代不超过50代，最快30代便实现了致弱，在传代过程中不添加胰酶。该致弱的猪流行性腹泻病毒变异毒株HeNAY16‑R具有很好的安全性，可有效预防由猪流行性腹泻病毒感染所造成的新生仔猪的腹泻以及死亡。

技术研发人员：陈陆,王川庆,高冬生,王新卫,杨霞,常洪涛,刘红英,王永生,杜季梅,郭占达
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1