基于双重PCR的检测PiAdv-I、PiAdv-II的引物组、试剂盒及方法

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种基于双重pcr的检测piadv-i、piadv-ii的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

1、我国养鸽历史悠久，尤其在近些年，赛鸽产业蓬勃发展，与此同时，带来了严重的疫病危机，给我国带来了巨大的经济损失，严重威胁养鸽业的健康发展。

2、腺病毒是感染鸽的一种常见致病性病原体，属于双股dna病毒中腺病毒科，病毒粒子无囊膜，二十面体对称，直径约为65nm。目前，已有研究证实腺病毒感染鸽子可引起两种临床表现，一种是以呕吐、虚弱、消化缓慢甚至停滞、排绿黏便或水便为特征的鸽腺病毒i型(pigeon adenovirus-i,piadv-i)，又称为典型腺病毒；另一种则是以突然死亡和坏死性肝炎为特征的鸽腺病毒ii型(pigeon adenovirus-ii,piadv-ii)。

3、piadv-i通常在3月份至7月份发生，呈典型的季节性，其中6月份的发病率最高，这种典型的季节性出现可能与每年的夏季赛鸽比赛有关。piadv只见于1岁以下的鸽子，已有研究证明，该病毒与幼鸽疾病综合征的发生密切相关。piadv-ii无明显季节性，全年均可发病，且可感染各个年龄段的鸽子。两种病毒均可垂直或水平传播。

4、目前，针对piadv-i、piadv-ii的分子生物学检测方法主要包括实时荧光定量pcr(rt-pcr)、环介导等温扩增技术(lamp)等。

5、实时荧光定量pcr(rt-pcr)是在核酸扩增反应过程中用荧光显示的化学物质来测定每个扩增循环完成后产物总量的方法。与普通pcr相比，更高效省时且灵敏，不仅能够快速检测样品，还可以有效避免反应结束后的交叉污染等问题。另一方面，rt-pcr也存在仪器昂贵、需要专业人士对结果进行分析、检测成本较高等不足。

6、环介导等温扩增技术(lamp)目前已广泛应用于各种微生物的筛选和识别。虽然灵敏度高、不需要特殊仪器，但实验过程中由于开盖造成的气溶胶污染，以及部分实验室功能分区不明确等，导致假阳性问题影响结果判断；并且该方法对引物设计要求较高，从而限制某些靶基因不适宜此法。

技术实现思路

1、针对以上要解决的技术问题，本发明的一个目的是提供一种能够操作简便、准确、快速地检测piadv-i、piadv-ii的引物组。

2、本发明的第二个目的是提供一种用于检测piadv-i、piadv-ii的试剂盒。

3、本发明的第三个目的是提供一种用于检测piadv-i、piadv-ii的方法。

4、为了实现以上发明目的，本发明提供了一种基于双重pcr的检测piadv-i、piadv-ii的引物组，所述引物组包括：

5、piadv-i-f：atccgccaacaattacatca；

6、piadv-i-r：tagacgatcgtggtgctgt；

7、piadv-ii-f：tctttagcactagttcaatgtgggat；

8、piadv-ii-r：attgtttgggttaaactgactat。

9、另一方面，本发明还提供了所述引物组用于同时检测piadv-i、piadv-ii的用途。

10、另一方面，本发明还提供了所述引物组用于制备同时检测piadv-i、piadv-ii的试剂的用途。

11、另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其试剂盒包括所述引物组。

12、另一方面，本发明还提供了所述试剂盒用于同时检测piadv-i、piadv-ii的用途。

13、另一方面，本发明还提供了所述试剂盒用于制备同时检测piadv-i、piadv-ii的试剂的用途。

14、另一方面，本发明还提供了一种基于双重pcr的检测piadv-i、piadv-ii的方法，其包括以下步骤：

15、(1)以待检测样品作为模板，使用权利要求1所述的引物组进行双重pcr扩增；

16、(2)扩增产物经凝胶电泳后，观察结果。

17、优选地，根据本发明所述的方法，所述双重pcr扩增的反应体系为：takara premixtaq5.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板1.0μl，ddh2o 3.0μl，总体积10.0μl。

18、优选地，根据本发明所述的方法，所述上游引物和所述下游引物的浓度为0.1μmol/l至10μmol/l，例如0.1μmol/l至1.0μmol/l，例如10μm。

19、优选地，根据本发明所述的方法，所述双重pcr扩增的反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min；12℃，∞。

20、与现有技术相比，本发明提供的双重pcr检测方法基于pcr方法，具有很高的灵敏度和很强的特异性，而且操作简单，与病原分离技术相比耗时更短，只需要直接利用样品中的核酸序列作为模板，在机体外模拟机体内病毒的复制过程进行扩增即可获得很多倍的核酸序列，并且能够在同一pcr反应管中对两种病毒进行检测，大大降低了检测成本和检测时间，具有良好的技术效果。

技术特征：

1.一种基于双重pcr的检测piadv-i、piadv-ii的引物组，其特征在于，所述引物组包括：

2.权利要求1所述的引物组用于同时检测piadv-i、piadv-ii的用途。

3.权利要求1所述的引物组用于制备同时检测piadv-i、piadv-ii的试剂的用途。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

5.权利要求4所述的试剂盒用于同时检测piadv-i、piadv-ii的用途。

6.权利要求4所述的试剂盒用于制备同时检测piadv-i、piadv-ii的试剂的用途。

7.一种基于双重pcr的检测piadv-i、piadv-ii的方法，其包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述双重pcr扩增的反应体系为：takarapremix taq 5.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板1.0μl，ddh2o 3.0μl，总体积10.0μl。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的浓度为0.1μmol/l至10μmol/l。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述双重pcr扩增的反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min；12℃，∞。

技术总结
本发明公开了一种基于双重PCR的检测PiAdv‑I、PiAdv‑II的引物组，其特征在于，所述引物组包括PiAdv‑I‑F：ATCCGCCAACAATTACATCA；PiAdv‑I‑R：TAGACGATCGTGGT GCTGT；PiAdv‑II‑F：TCTTTAGCACTAGTTCAATGTGGGAT；PiAdv‑II‑R：ATTGTTTGGG TTAAACTGACTAT。本发明还提供了包括该引物组的试剂盒，以及该引物组、试剂盒在检测PiAdv‑I、PiAdv‑II中的应用。本发明能够灵敏地、特异性地在同一PCR反应管中对两种病毒进行检测，而且操作简单，大大降低了检测成本和检测时间。

技术研发人员：黄淑坚,刘梦凡,梅堃,刘兆洁,柯骏鸿,姜含雨,赵梓桥,魏无缺,陈作鑫,李树稳
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12