一种制备人促血小板生成素的方法及人促血小板生成素与流程

本发明涉及生物药物领域，特别是一种制备人促血小板生成素的方法以及由此获得的人促血小板生成素。

背景技术：

1、tpo(血小板生成素)是一种人体内源的生长因子，对巨核细胞增殖、分化、成熟起调节作用，是治疗血小板减少症的重要研究方向和途径。沈阳三生制药有限公司生产的重组tpo(商品名:特比澳)已上市多年，用于化疗相关的血小板减少症(cit)和原发免疫性血小板减少症(itp)，被认为是第一代促血小板生成剂。但重组tpo在人体的半衰期较短，临床需每天注射，连续给药，患者顺应性差。因此，多家制药企业在开发以长效化为目的的第二代tpo产品。主要长效化的技术包括peg修饰和融合表达两种。前者如amgen公司将tpo蛋白n端含163个氨基酸的活性结构域进行peg修饰，修饰后的蛋白显著延长了半衰期，在临床试验上实现了10天给药一次。但由于该活性结构域采用大肠杆菌表达，缺少糖基化修饰，在人体中产生了中和抗体，并且中和抗体与内源tpo发生交叉反应，造成严重的副作用，最终导致临床试验失败。融合表达多采用将tpo拟肽或具有升血小板活性的肽段与fc融合的办法，通过fc融合增大蛋白分子量，降低肽段的肾排泄，达到长效化的目的。如已获fda批准用于itp治疗的罗米司亭，即为一种人促血小板生成素模拟肽-fc融合蛋白，临床使用频次为每周给药一次，患者治疗的便利度获得极大的提高。

2、本专利用peg对全长tpo蛋白进行修饰，tpo为cho细胞重组表达获得，具有完整的糖基化修饰，较大肠杆菌表达的tpo结构域的免疫原性更低，安全性更好，通过对修饰剂的对比和筛选，获得的修饰分子在大鼠中的半衰期延长了2倍，达到了长效化的目的，为人体试验奠定了基础。

技术实现思路

1、因此为了解决上述的技术问题，本发明提出了如下解决方案：

2、一种制备人促血小板生成素的方法，包括如下步骤：步骤1，制备修饰用tpo；步骤2，通过scm-peg40k对tpo进行修饰反应，其中scm-peg40k为带有活性基团为琥珀酰亚胺乙醇酯(scm)的peg作为修饰剂，其分子量为40kda，设置tpo溶液的蛋白质浓度为0.5-2.0mg/ml，设置tpo与scm-peg40k的摩尔比为1:3-1:20，并且将反应时间设定为2-18小时；步骤3，对步骤2所获得的tpo-peg40kscm产物进行纯化。

3、根据本发明的一个优选实施例，在所述步骤3中包括步骤3.1阴离子交换层析；步骤3.2将阴离子交换层析的洗脱液进一步用分子筛层析。

4、优选地，所述步骤1包括：合成tpo的编码dna序列，克隆进入pcdna3.1表达载体中；提取质粒用lipofectamine 2000转染cho细胞株，通过在培养基中加入嘌呤霉素筛选获得阳性细胞池；将阳性细胞池按0.5个细胞/孔的密度有限稀释至96孔板中，待单克隆细胞生长至50％汇合度时用elisa试剂盒筛选高表达细胞克隆；挑取表达量最高的克隆在三角瓶中进行扩增培养；当细胞密度生长至2×10e6个/ml时，取400ml接种到含2l基础培养基的7l生物反应器中继续培养，生物反应器设定温度37℃，ph7.0，搅拌80rpm，溶氧50％；监测并补加葡萄糖至终浓度5g/l，培养后期添加补料等营养元素；生物反应器上培养10天后，停止培养，离心收集上清；将上清依次用阳离子层析、疏水层析、分子筛层析进行纯化，获得纯度＞98％，比活性≥2.5×10e5u/mg的纯品蛋白。

5、本发明还涉及一种用上述的制备人促血小板生成素的方法制备的人促血小板生成素。

6、通过对多种peg修饰剂的对比筛选，确定修饰效果最好的peg分子量为40kda，活性基团为scm，用该peg修饰后活性损失较少，同时可以获得单位点peg修饰的tpo分子，修饰后分子的结构均一，有利于产物的分离纯化和鉴定，也有利于对产物的质量进行分析和控制，实现批间一致性，方便产业化。本专利研发的tpo-peg修饰分子的体内半衰期比tpo显著延长，达到长效的效果，预计临床可5-7天注射给药一次。

7、通过peg修饰延长tpo的半衰期。scm活性基团可以与蛋白n端和赖氨酸的氨基进行反应，tpo分子中含有7个赖氨酸，均为潜在的修饰位点，容易发生多位点修饰。我们的实验也显示，当用分子量20k的scm-peg20k进行修饰时，产物不均一，含有多位点修饰产物。意外的是，当peg分子量40k时，虽然还是带有scm活性基团，但修饰产物却为单peg修饰。

技术特征：

1.一种制备人促血小板生成素的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，制备修饰用tpo；步骤2，通过scm-peg40k对tpo进行修饰反应，其中scm-peg40k为带有活性基团为琥珀酰亚胺乙醇酯(scm)的peg作为修饰剂，其分子量为40kda，设置tpo溶液的蛋白质浓度为0.5-2.0mg/ml，设置tpo与scm-peg40k的摩尔比为1:3-1:20，并且将反应时间设定为2-18小时；步骤3，对步骤2所获得的tpo-peg40kscm产物进行纯化。

2.根据权利要求1所述的制备人促血小板生成素的方法，其特征在于，在所述步骤3中包括步骤3.1阴离子交换层析；步骤3.2将阴离子交换层析的洗脱液进一步用分子筛层析。

3.根据权利要求2所述的制备人促血小板生成素的方法，其特征在于，所述步骤1包括：合成tpo的编码dna序列，克隆进入pcdna3.1表达载体中；提取质粒用lipofectamine 2000转染cho细胞株，通过在培养基中加入嘌呤霉素筛选获得阳性细胞池；将阳性细胞池按0.5个细胞/孔的密度有限稀释至96孔板中，待单克隆细胞生长至50％汇合度时用elisa试剂盒筛选高表达细胞克隆；挑取表达量最高的克隆在三角瓶中进行扩增培养；当细胞密度生长至2×10e6个/ml时，取400ml接种到含2l基础培养基的7l生物反应器中继续培养，生物反应器设定温度37℃，ph7.0，搅拌80rpm，溶氧50％；监测并补加葡萄糖至终浓度5g/l，培养后期添加补料等营养元素；生物反应器上培养10天后，停止培养，离心收集上清；将上清依次用阳离子层析、疏水层析、分子筛层析进行纯化，获得纯度＞98％，比活性≥2.5×10e5u/mg的纯品蛋白。

4.一种用根据权利要求1-4中任一项所述的制备人促血小板生成素的方法制备的人促血小板生成素。

技术总结
一种制备人促血小板生成素的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，制备修饰用TPO；步骤2，通过SCM‑PEG40K对TPO进行修饰反应，其中SCM‑PEG40K为带有活性基团为琥珀酰亚胺乙醇酯(SCM)的PEG作为修饰剂，其分子量为40kDa，设置TPO溶液的蛋白质浓度为0.5‑2.0mg/ml，设置TPO与SCM‑PEG40K的摩尔比为1:3‑1:20，并且将反应时间设定为2‑18小时；步骤3，对步骤2所获得的TPO‑PEG40KSCM产物进行纯化。还涉及相应的人促血小板生成素。

技术研发人员：薛剑峰
受保护的技术使用者：北京康禾科创生物科技开发有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14