一种可以稳定重复用于D-阿洛酮糖转化合成的地衣芽孢杆菌细胞的制作方法

本发明涉及一种可以稳定重复用于d-阿洛酮糖转化合成的地衣芽孢杆菌细胞，属于生物。

背景技术：

1、d-阿洛酮糖是在自然界中存在但含量极少的糖类，其甜度达到蔗糖的70％，有清凉感，无苦味。同时，d-阿洛酮糖在人体内不能代谢或者代谢很少，被评价为最具潜力的蔗糖替代品，在食品、医药、保健等领域具有广泛的应用前景。

2、d-阿洛酮糖通过化学途径合成难度大，效率低。生物转化法具有反应条件温和、副产物少、纯化步骤简单、绿色环保等优点，逐渐成为d-阿洛酮糖合成的主要方向。目前d-阿洛酮糖的生物转化主要利用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌等宿主表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-psicose 3-epimerase)，再利用细胞破碎获得纯酶，以d-果糖为底物转化合成d-阿洛酮糖。这种生产方式中，作为催化剂的纯酶仅能使用一次，且为产物的分离带来了不变。目前利用全细胞转化合成d-阿洛酮糖的报道比较少，主要使用的宿主细胞也为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌等。全细胞催化省去了发酵后细胞破碎的步骤，而且催化剂可以通过离心或过滤很方便地与产物进行分离。然而，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌的细胞在60-70℃的催化温度下容易裂解；即使对细胞进行回收，在过程中极易感染噬菌体。因此，全细胞催化剂难以实现重复利用。

3、地衣芽孢杆菌是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generally regarded as safe”(gras)安全级别。另一方面，该菌株是一种典型的耐热微生物，可以在50℃生长，培养好的细胞在60-70℃稳定性极好，且极少存在噬菌体感染的问题。利用地衣芽孢杆菌构建的工程菌，可以稳定重复用于d-阿洛酮糖转化合成，在生产效率和成本方面与现有方法相比具有明显的优势。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

2、本发明的第二个目的是提供表达上述基因的载体。

3、本发明的第三个目的是提供携带上述基因或上述重组载体的细胞。

4、在一种实施方式中，所述细胞为地衣芽孢杆菌。

5、本发明的第四个目的是提供一种重组地衣芽孢杆菌，携带上述编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因。

6、在一种实施方式中，所述重组地衣芽孢杆菌的表达载体为phy300-plk。

7、在一种实施方式中，所述重组地衣芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌cicim b1341为宿主。

8、在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌cicim b1341出自中国高效工业微生物资源平台中保存的天然菌株。

9、本发明的第五个目的在于提供一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂包含上述重组地衣芽孢杆菌。

10、本发明的第六个目的在于提供所述重组地衣芽孢杆菌的构建方法，是将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因a1与启动子plan、终止子ter融合获得整合片段，将整合片段连接至phy300-plk载体后，获得重组质粒phy300-plan-a1，将重组质粒转入地衣芽孢杆菌，通过传代培养将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的表达框整合入地衣芽孢杆菌基因组中淀粉酶编码基因(amyl)的位点。

11、本发明的第七个目的在于提供一种全细胞转化合成d-阿洛酮糖的方法，是以d-果糖为底物，加入所述重组地衣芽孢杆菌或所述全细胞催化剂的湿菌体，50～70℃反应5～10h。

12、在一种实施方式中，反应结束后还可以利用离心或过滤回收所述重组地衣芽孢杆菌或所述全细胞催化剂，重复使用，加入到以d-果糖为底物的反应体系中合成d-阿洛酮糖。

13、在一种实施方式中，所述重复使用的次数为10次以上。

14、在一种实施方式中，所述重组地衣芽孢杆菌或所述全细胞催化剂接种于种子培养基中37℃-42℃培养12-24h后，以体积比1％-5％的接种量转接于发酵培养基中，37℃-42℃培养24-36h，收集湿菌体。

15、在一种实施方式中，所述湿菌体的od600值为50～100。

16、在一种实施方式中，所述的种子培养基包括胰蛋白胨8-12g/l、酵母粉4-6g/l、nacl 8-12g/l。

17、在一种实施方式中，所述的发酵培养基包括(g/l)：蔗糖20-70、棉籽蛋白10-30、k2hpo4·3h2o 9.12、kh2po4 1.36、(nh4)2hpo4 10；初始ph 7.5。

18、本发明还提供上述基因，或上述载体，或上述细胞，或上述重组地衣芽孢杆菌，或上述全细胞催化剂在制备含有d-阿洛酮糖的产品中的应用。

19、与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

20、本发明以食品安全型微生物地衣芽孢杆菌为出发菌株，利用其细胞对高温很好的耐受能力在催化过程中对胞内所表达的d-阿洛酮糖3-差向异构酶提供保护。本发明将核苷酸序列如seq id no.1所示的编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因构建至地衣芽孢杆菌中，获得全细胞催化剂，所述全细胞催化剂重复使用10次后，转化率仍然不低于30％。相对于其他催化剂一次性使用的纯酶转化或全细胞催化法，本发明的技术方案在生产成本和效率方面具有显著的优势。

技术特征：

1.一种编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.含有权利要求1所述基因的载体。

3.携带权利要求1所述基因或权利要求2所述载体的细胞。

4.根据权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述细胞为地衣芽孢杆菌细胞。

5.一种重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，以地衣芽孢杆菌cicim b1341为宿主，携带权利要求1所述的基因。

6.根据权利要求5所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌包括地衣芽孢杆菌9945a。

7.一种全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂包含权利要求5或6所述重组地衣芽孢杆菌。

8.一种全细胞转化合成d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，以d-果糖为底物，加入权利要求5或6所述重组地衣芽孢杆菌，或权利要求7所述全细胞催化剂，50-70℃反应5～10h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应结束后，利用离心或过滤回收所述重组地衣芽孢杆菌或所述全细胞催化剂，重复使用，加入到以d-果糖为底物的反应体系中合成d-阿洛酮糖。

10.权利要求1所述基因，或权利要求2所述载体，或权利要求3或4所述细胞，或权利要求5或6所述重组地衣芽孢杆菌，或权利要求7所述全细胞催化剂在制备含有d-阿洛酮糖的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种可以稳定重复用于D‑阿洛酮糖转化合成的地衣芽孢杆菌细胞，属于生物技术领域领域。D‑阿洛酮糖是一种具有较高健康价值的功能性糖，在食品、医药、保健等领域具有广泛的应用前景。本发明的地衣芽孢杆菌细胞高效表达了重组的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，可以高浓度的果糖为底物转化生成D‑阿洛酮糖。所述的全细胞催化剂重复使用10次后，转化率不低于30％。相对于纯酶或者一次性使用的全细胞转化方式，本技术合成D‑阿洛酮糖具有催化剂使用成本低，分离纯化简单等显著优势。

技术研发人员：李由然,石贵阳
受保护的技术使用者：无锡特殊食品与营养健康研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12