一种提高重组蛋白表达水平的方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种提高重组蛋白表达水平的方法。

背景技术：

1、与依靠于动物免疫制备、杂交瘤技术生产的传统抗体不同，重组抗体一般指通过基因工程技术改造、大规模细胞培养而获得的单克隆抗体及更小分子量的工程抗体。重组抗体具有几个关键优势，包括抗体结构明确、极高的批次间一致性、持续大规模供应能力以及对抗体工程的适应性。利用重组技术生产抗体有助于解决抗体的大规模生产需要，同时重组抗体在生物制药和科学研究领域中的应用十分广泛，如免疫沉淀试验，酶联免疫试验，蛋白质印迹等分析实验。因此如何实现重组抗体的高产量高活性制备一直备受关注，目前在大规模生产中重组抗体的可溶性表达与产量的限制仍是其主要瓶颈。

2、重组抗体技术是将体内获得的抗体基因信息通过基因工程的方法连接到表达载体上，再将构建好的表达载体转化至宿主细胞内，通过大规模培养和纯化从而获得重组抗体的技术。目前，重组抗体的表达生产方法主要分为真核表达系统和原核表达系统两大类：原核表达系统主要利用大肠杆菌e.coli作为表达菌株，具有成本低、产量大、技术要求低等优点，但容易遇到表达抗体无活性、可溶性丧失、以包涵体形式存在等问题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种提高重组蛋白表达水平的方法。

2、现有的原核表达系统中重组蛋白的表达无活性、可溶性丧失、以包涵体形式存在等问题，主要是因为蛋白依赖于正确的二硫键分子间、分子内键合以维持其三级、四级结构，而大肠杆菌细胞质的还原环境不利于二硫键的形成与异构化，因此导致重组蛋白无法正常折叠、呈现正确的三维结构。目前仅有只含单个二硫键的单域重链抗体(vhh)易于在大肠杆菌中高产量可溶性表达，其余含有多个二硫键组成的重组蛋白多以真核表达系统为主；真核表达系统主要为酵母表达系统、哺乳动物表达系统及昆虫表达系统，得益于真核细胞所具有的完整蛋白翻译及修饰系统，重组蛋白在真核表达系统中更易形成正确、稳定的二硫键，同时在翻译后进行糖基化等修饰功能，使表达出来的抗体更具天然活性而不易被降解或是形成包涵体。然而，真核表达系统生产成本高昂、表达周期长、操作繁琐，真核细胞耐受性差难以建立稳定表达株系，同时不可控、难以预知的糖基化等修饰作用也对重组蛋白的下游应用产生极大风险。

3、虽然大肠杆菌表达系统缺乏翻译后修饰功能，但对重组蛋白而言，糖基化等修饰作用并不是其结构稳定性与生物活性的必要因素。相反，没有额外修饰作用的影响，原核表达重组蛋白具有更小的异质性特征。为实现富含多个二硫键的重组蛋白在大肠杆菌中的高效成功表达，本发明通过对多种二硫键酶的筛选发现重组蛋白在大肠杆菌胞内的原核表达有望得到解决。在此，我们首次发明了一种大肠杆菌二硫键酶辅助的重组蛋白胞内表达方法，并检验了该方法在提高重组蛋白可溶性表达与产量中的应用。

4、第一方面，本发明提供一种提高重组蛋白表达水平的方法，包括：

5、在表达重组蛋白的同时，表达二硫键酶；

6、所述二硫键酶为大肠杆菌源的二硫键酶。

7、并非任意形式的二硫键酶可以起到提高重组蛋白活性和表达水平的效果，除了大肠杆菌源的二硫键酶基因在应用时往往无法起到作用。

8、进一步地，所述表达二硫键酶包括：在包括所述重组蛋白的基因的载体上连接二硫键酶基因，或导入包括所述重组蛋白的基因的载体时，同时导入所述二硫键酶基因。

9、进一步地，所述重组蛋白之前采用强启动子控制元件，所述二硫键酶基因前采用弱启动子控制元件。该设计方式可以进一步提供重组蛋白的产量和活性。

10、进一步地，所述二硫键酶包括如seq id no1.或seq id no.2所示的氨基酸序列。

11、进一步地，所述二硫键酶基因包括如seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列。

12、本发明筛选得到两种效果较优的二硫键酶基因，其不对大肠杆菌的生长产生影响，同时十分高效，具有分子伴侣活性，表达过程可保护重组抗体不被蛋白酶降解。最终可以显著提高重组蛋白的表达。而采用其他大肠杆菌源的二硫键酶基因时虽然可以提高重组蛋白的表达，但是效率较低。

13、进一步地，包括所述重组蛋白的基因的载体上连接二硫键酶基因之后得到的载体包括如seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸序列。

14、进一步地，所述表达重组蛋白为采用大肠杆菌表达系统，表达所述重组蛋白。

15、进一步地，所述大肠杆菌表达系统为origami系大肠杆菌表达系统。本发明提供的提高重组蛋白表达水平的方法最适用于origami系大肠杆菌表达系统，其可以显著该表达系统表达蛋白时的活性和表达水平。

16、进一步地，所述重组蛋白为重组抗体。

17、第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括二硫键酶基因，所述二硫键酶包括如seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列。

18、进一步地，所述表达载体的核苷酸序列如seq id no.5或seq id no.6所示。

19、本发明进一步提供所述表达载体在提高重组蛋白的表达水平中的应用。

20、本发明具备如下有益效果：

21、1、本发明提供一种提高重组蛋白可溶性表达与产量的方法，较以往原核表达方法大幅提升了重组蛋白可溶性，有效解决了包涵体所造成的抗体失活问题，同时免去了其繁琐、不可预知的复性操作，相比之下最终所获得的高纯度高活性重组蛋白产率提升程度在3-10倍范围，将重组蛋白原核表达生产成本降低了数倍。

22、2、本发明的提高重组蛋白表达水平的方法，简化了重组蛋白纯化步骤，免去了重组蛋白酶切去除多余融合标签的步骤，可做到一步提纯获得高纯度重组蛋白。本发明采用自主改进和构建的载体pd-p1，以puc57为骨架，在二硫键酶表达盒前面构建弱启动子控制元件，在重组蛋白多克隆位点前面构建强启动子控制元件，在获得必要的二硫键酶分子伴侣的同时，独立表达并极大地提高了重组蛋白的产率。

23、3、本发明提供的方法可以适用于多种重组蛋白的高效可溶性表达，尤其适用于新抗原受体可变域(vnar)、单域重链抗体(vhh)、单链可变区片段(scfv)和抗体可变区片段(fv)等工程抗体的生产制备。所生产的重组蛋白含有正确折叠的二硫键，同时具有完全的免疫结合生物活性，进一步地，该方法具有高效可溶性表达生产结构更为复杂的多特异性抗体的潜力。

24、4、本发明提供的提高重组蛋白表达水平的方法中，全细胞培养均采用国产化培养基，相较于进口培养基可大幅节约原料成本，同时重组蛋白的产率稳定，适用于大体积大规模上罐培养和放大生产。

技术特征：

1.一种提高重组蛋白表达水平的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达二硫键酶包括：在包括所述重组蛋白的基因的载体上连接二硫键酶基因，或导入包括所述重组蛋白的基因的载体时，同时导入所述二硫键酶基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述二硫键酶包括如seq id no1.或seq id no.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二硫键酶基因包括如seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求2任一项所述的方法，其特征在于，包括所述重组蛋白的基因的载体上连接二硫键酶基因之后得到的载体包括如seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达重组蛋白为采用大肠杆菌表达系统，表达所述重组蛋白。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在不，所述重组蛋白为重组抗体。

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括二硫键酶基因，所述二硫键酶包括如seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如seq idno.5或seq id no.6所示。

10.权利要求8或9所述的表达载体在提高重组蛋白的表达水平中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种提高重组蛋白表达水平的方法。所述方法包括：在表达重组蛋白的同时，表达二硫键酶；所述二硫键酶为大肠杆菌源的二硫键酶。本发明研究发现，在表达重组蛋白的同时表达特定二硫键酶可以极大地提高重组蛋白的表达水平。该方法适用于各类重组蛋白的表达，尤其适用于单克隆抗体(mAb)等工程抗体的生产制备。

技术研发人员：许艇,唐宗文,郝雨阳,吴纱
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27