一种用于在昆虫细胞中产生rAAV的核酸、VP1衣壳蛋白突变体及应用的制作方法

本发明属于基因工程，更具体地，涉及一种用于在昆虫细胞中产生raav的核酸、vp1衣壳蛋白突变体及应用。

背景技术：

1、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链dna缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。重组腺相关病毒(raav)由于具有宿主范围广、免疫原性低、安全性高、可介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。随着第一种重组腺相关病毒(raav)介导的基因治疗药物的批准，对大规模aav载体制造技术的需求不断增加(yla-herttuala s.,2012,mol ther,20:1831-1832)。

2、产生大量重组腺相关病毒(raav)载体的能力是开发基于基因治疗的药物的重要因素。目前，生产raav的体系主要有两大类：一种是利用哺乳动物细胞(如293细胞、cos细胞、hela细胞、kb细胞等)的常规生产体系；另一种是利用昆虫细胞的生产体系。在哺乳动物细胞生产体系中，单个细胞的raav颗粒产量低，并且培养中极可能存在污染的风险，这限制了raav在哺乳动物细胞中的大规模生产及应用。杆状病毒/昆虫细胞表达系统是大规模生产raav的主要系统之一。重组腺相关病毒基因组中cap基因编码病毒vp衣壳蛋白，包括三种结构蛋白，分别为vp1、vp2和vp3，来自野生型病毒的aav中vp1、vp2和vp3的化学计量比约为1:1:10，这样的化学计量比对于重组aav的获得是很重要的。

3、尽管杆状病毒/昆虫细胞表达系统已成功在多种规模下用于raav生产，但是已有多项研究报道相比于利用哺乳动物细胞生产raav，昆虫细胞中生产的raav具有减少的vp1含量，从而导致raav的产率降低。因此，欲实现工业化大规模生产raav，杆状病毒/昆虫细胞系统仍需改善。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于在昆虫细胞中产生raav的核酸、vp1衣壳蛋白突变体及应用，旨在解决野生型aav血清8型vp1蛋白不稳定、易降解从而导致raav产率降低的问题。

2、为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种核酸，其包含编码腺相关病毒vp1、vp2和vp3蛋白的核苷酸序列，与野生型aav血清8型的衣壳蛋白相比，所述vp1蛋白的氨基酸序列包含在第84、92和105位中的一个或多个位点的突变，且所述vp2蛋白的氨基酸序列未突变。

3、优选地，所述vp1蛋白的氨基酸序列包含一个或多个选自以下的突变：q84k、r92k和q105k。

4、优选地，除所述突变外，所述vp1蛋白的其它氨基酸序列与野生型aav血清8型的vp1蛋白的氨基酸序列相同。

5、优选地，所述核酸还包含能够在昆虫细胞中驱动转录的启动子，所述启动子的3’端可操作连接有内含子；所述vp1蛋白的起始密码子atg位于所述内含子的序列之中，或者，所述vp1蛋白对应的cap基因编码区缺失起始密码子且所述内含子位于atg中的任意相邻两个核苷酸之间；所述内含子不包含能够在昆虫细胞中驱动转录的启动子；

6、所述核酸在昆虫细胞中仅能转录得到一种前体mrna，且在转录后加工过程中，仅通过所述内含子的选择性剪接作用，使得所述vp1蛋白的起始密码子atg保留或缺失，或者在vp1蛋白对应的cap基因编码区中形成起始密码子atg，从而实现调控所述vp1、vp2和vp3蛋白的翻译表达。

7、进一步优选地，所述vp1蛋白的起始密码子atg位于所述内含子的序列之中，且所述内含子的3’端可操作连接有编码2a自剪切多肽的核苷酸序列。

8、进一步优选地，所述2a自剪切多肽为t2a肽、p2a肽、e2a肽或f2a肽。

9、第二方面，本发明了提供一种腺相关病毒vp1衣壳蛋白突变体，其由本发明第一方面所述的核酸编码得到。

10、第三方面，本发明提供了一种昆虫细胞，其包含本发明第一方面所述的核酸，所述核酸为杆状病毒载体。

11、优选地，所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞、粉纹夜蛾细胞、果蝇细胞或蚊子细胞。

12、进一步优选地，所述昆虫细胞还包含另一杆状病毒载体，所述另一杆状病毒载体包含aav的rep基因表达盒、外源基因以及位于所述外源基因两端的aav反向末端重复序列。

13、进一步优选地，所述外源基因为报告基因，所述报告基因为氯霉素乙酰转移酶编码基因、β-半乳糖苷酶编码基因、β-葡萄糖醛酸酶编码基因、海肾荧光素酶编码基因、碱性磷酸酶编码基因、萤火虫荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和红色荧光蛋白编码基因中的至少一种。

14、进一步优选地，所述外源基因为编码药物多肽的基因，所述药物多肽为脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素和干扰素中的至少一种。

15、第四方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒粒子，所述重组腺相关病毒粒子的衣壳包含本发明第二方面所述的腺相关病毒vp1衣壳蛋白突变体。

16、第五方面，本发明还提供了一种重组腺相关病毒粒子，其在本发明第三方面所述的昆虫细胞中产生。

17、第六方面，本发明提供了一种生产重组腺相关病毒粒子的方法，其是在能产生重组腺相关病毒粒子的条件下培养第三方面所述的昆虫细胞，然后回收制得的。

18、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明通过对野生型aav血清8型的vp1蛋白独有区域的氨基酸序列进行特定位点(第84、92、105位)的突变，而未在现有公开的蛋白质水解区域进行突变，能够减少昆虫细胞中vp1蛋白的降解，得到更合适比例的vp1、vp2和vp3蛋白，使得正确组装成raav的衣壳，从而提高利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统生产raav的产率和效力。

技术特征：

1.一种核酸，其特征在于：包含编码腺相关病毒vp1、vp2和vp3蛋白的核苷酸序列，与野生型aav血清8型的衣壳蛋白相比，所述vp1蛋白的氨基酸序列包含在第84、92和105位中的一个或多个位点的突变，且所述vp2蛋白的氨基酸序列未突变。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述vp1蛋白的氨基酸序列包含一个或多个选自以下的突变：q84k、r92k和q105k。

3.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于：除所述突变外，所述vp1蛋白的其它氨基酸序列与野生型aav血清8型的vp1蛋白的氨基酸序列相同。

4.根据权利要求1-3任一所述的核酸，其特征在于，还包含能够在昆虫细胞中驱动转录的启动子，所述启动子的3’端可操作连接有内含子；所述vp1蛋白的起始密码子atg位于所述内含子的序列之中，或者，所述vp1蛋白对应的cap基因编码区缺失起始密码子且所述内含子位于atg中的任意相邻两个核苷酸之间；所述内含子不包含能够在昆虫细胞中驱动转录的启动子；

5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于：所述vp1蛋白的起始密码子atg位于所述内含子的序列之中，且所述内含子的3’端可操作连接有编码2a自剪切多肽的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于：所述2a自剪切多肽为t2a肽、p2a肽、e2a肽或f2a肽。

7.一种腺相关病毒vp1衣壳蛋白突变体，其特征在于：由权利要求1-6任一所述的核酸编码得到。

8.一种昆虫细胞，其特征在于：包含权利要求1-6任一所述的核酸，所述核酸为杆状病毒载体。

9.根据权利要求8所述的昆虫细胞，其特征在于：所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞、粉纹夜蛾细胞、果蝇细胞或蚊子细胞。

10.根据权利要求8或9所述的昆虫细胞，其特征在于：还包含另一杆状病毒载体，所述另一杆状病毒载体包含aav的rep基因表达盒、外源基因以及位于所述外源基因两端的aav反向末端重复序列。

11.根据权利要求10所述的昆虫细胞，其特征在于：所述外源基因为报告基因，所述报告基因为氯霉素乙酰转移酶编码基因、β-半乳糖苷酶编码基因、β-葡萄糖醛酸酶编码基因、海肾荧光素酶编码基因、碱性磷酸酶编码基因、萤火虫荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和红色荧光蛋白编码基因中的至少一种。

12.根据权利要求10所述的昆虫细胞，其特征在于：所述外源基因为编码药物多肽的基因，所述药物多肽为脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素和干扰素中的至少一种。

13.一种重组腺相关病毒粒子，其特征在于：所述重组腺相关病毒粒子的衣壳包含权利要求7所述的腺相关病毒vp1衣壳蛋白突变体。

14.一种重组腺相关病毒粒子，其特征在于：在权利要求8-12任一所述的昆虫细胞中产生。

15.一种生产重组腺相关病毒粒子的方法，其特征在于：是在能产生重组腺相关病毒粒子的条件下培养权利要求8-12任一所述的昆虫细胞，然后回收制得的。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种用于在昆虫细胞中产生rAAV的核酸、VP1衣壳蛋白突变体及应用，该核酸包含编码腺相关病毒VP1、VP2和VP3蛋白的核苷酸序列，与野生型AAV血清8型的衣壳蛋白相比，所述VP1蛋白的氨基酸序列包含在第84、92和105位中的一个或多个位点的突变，且所述VP2蛋白的氨基酸序列未突变。本发明将VP1蛋白编码序列进行突变，能够减少昆虫细胞中VP1蛋白的降解，使得表达的VP1、VP2和VP3维持合适的比例以正确组装成衣壳，从而提高利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统生产rAAV的产率和效力。

技术研发人员：肖何,何晓斌,黄刚,胡颖,潘杏,王梦蝶,杜亮
受保护的技术使用者：睿征医药科技（武汉）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14