抗IGF1R单域抗体及其融合蛋白和人源化单域抗体的制备及应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体的说涉及单域抗体，尤其涉及抗igf1r单域抗体及其融合蛋白和人源化单域抗体的制备及应用。

背景技术：

1、甲状腺眼病(thyroid eye diseases，ted)，又名甲亢性突眼症，是一种严重进行性、威胁视力的自身免疫性疾病，是成人最常见的眼眶疾病。ted的发病机制尚未完全明确，目前主要被认为是由于甲状腺功能亢进，新陈代谢过度旺盛所致，其中促甲状腺素受体(tshr)和胰岛素样生长因子受体-1(igf1r)复合体的激活是ted非常重要的环节，会导致眶内异常的免疫增殖反应，引起眼外肌的肥大及眶内脂肪组织的增多，从而导致突眼、复视、视力模糊、疼痛、压迫性视神经病变等各种临床表现。

2、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor，igf-1r)属于酪氨酸蛋白激酶受体家族，是一种细胞表面的跨膜蛋白，可被igf-1及igf-2(均为胰岛素增长因子)激活，其过度表达可能与多发性硬化、克罗恩病、肺纤维化等恶性肿瘤及自身免疫性疾病发病相关。igf-1r相关的igg可激活甲状腺相关性眼病患者来源的igf-1r阳性的眼眶成纤维细胞，从而激活akt/frap/mtor/p70s6k通道诱导眼眶成纤维细胞上白细胞介素-16和调节活化正常t细胞表达和分泌的因子(regulated upon activation normal tcell expressed and secreted factor，rantes)的表达，促进t细胞趋化因子的合成，引起t淋巴细胞的炎性浸润和透明质酸的产生。

3、igf1r抗体发挥治疗作用的关键是能够阻断igf1r与其配体igf1的结合。2020年，美国fda批准了抗igf1r抗体teprotumumab(商品名为tepezza)用于甲状腺眼病的治疗。这也是目前全球唯一一个获批的治疗甲状腺眼病的药物。临床试验表明，接受teprotumumab治疗的患者眼球突出发生了显著减少。其iii期临床研究结果显示，研究达到主要终点，且耐受性良好。但已上市产品teprotumumab不能完全阻断igf1r和igf1的结合，而本发明抗体能够完全阻断igf1r和igf1的结合，同时也能阻断igf1r和igf2的结合，比teprotumumab具有更高的亲和力和生物功能抑制活性，可以在更低剂量条件下起效以及具有优于teprotumumab的预期临床疗效。因此，开发新型的用于治疗该疾病的igf-1r治疗性抗体十分必要。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明提供了一种能够结合igf-1r的单域抗体、融合蛋白及其人源化单域抗体的制备方法，为开发新型的、用于igf1r介导的相关疾病的治疗提供了新途径。

2、技术方案：一组igf1r单域抗体，所述单域抗体包括3个独特序列，相对应的克隆号为1d7、3b9和3g6，均由cdr区和可变区组成。

3、进一步的，所述独特序列1d7中cdr区的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq idno.2和seq id no.3所示，可变区的氨基酸序列为seq id no.10。

4、进一步的，所述独特序列3b9中cdr区的氨基酸序列分别如seq id no.4、seq idno.5和seq id no.6所示，可变区的氨基酸序列为seq id no.11。

5、进一步的，所述独特序列3g6中cdr区的氨基酸序列分别如seq id no.7、seq idno.8和seq id no.9所示，可变区的氨基酸序列为seq id no.12。

6、一种融合蛋白，将所述的igf1r单域抗体与人igg1 fc(vhh的c端与人fc铰链区n端直接相连)的核酸序列的pcdna3.1重组载体得到单域抗体-fc融合蛋白。

7、进一步的，所述人igg1 fc区域序列如seq id no.13所示；单域抗体-fc融合蛋白序列如seq id no.14、seq id no.15和seq id no.16所示。

8、人源后的igf1r单域抗体，将所述的单域抗体3b9的可变区进行人源化改造得到8个人源化的抗体3b9-hz1，可变区；3b9-hz2，可变区；3b9-hz3，可变区；3b9-hz4，可变区；3b9-hz5，可变区；3b9-hz6，可变区；3b9-hz7，可变区；和3b9-hz8，可变区；其氨基酸序列分别如seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq idno.22、seq id no.23和seq id no.24所示。

9、上述igf1r单域抗体、融合蛋白以及人源后的igf1r单域抗体在igf1r过度表达诱发的相关疾病的药物中的应用。

10、进一步的，所述相关疾病包括甲状腺眼病等。

11、抗igf1r单域抗体、融合蛋白及其人源化单域抗体的制备方法，包括以下步骤：

12、s1：一组igf1r单域抗体的制备和筛选方法

13、(1)羊驼的免疫:使用重组人igf1r蛋白(购自北京义翘神州，货号10164-h08h)免疫小羊驼(alpaca)；

14、(2)免疫文库构建：使用m13ko7辅助噬菌体侵染，制备得到噬菌体展示文库；

15、(3)噬菌体文库的淘选：采用固相亲和筛选法淘选靶向igf1r的单域抗体，共进行三轮淘选，将测序获得的dna序列翻译成氨基酸序列后进行比对，去除重复序列或cdr3相差1个氨基酸的相似序列，得到独特序列，相对应的克隆号为1d7、3b9和3g6(其cdr区氨基酸序列和可变区氨基酸序列如下面表1所示，其中cdr区域使用kabat方法划分)。

16、s2：一种融合蛋白的制备方法

17、将s1中的单域抗体与人igg1 fc(vhh的c端与人fc铰链区n端直接相连)的核酸序列的pcdna3.1重组载体得到单域抗体-fc融合蛋白。

18、s3：单域抗体人源化方法

19、设计3b9-hz1至3b9-hz8人源化后的抗体序列(序列如表3所示)。将这些人源化序列构建到人igg1 fc(序列如seq id no:13所示)上，形成单域抗体-fc融合蛋白。通过瞬时转染expi293哺乳动物表达系统，表达和纯化这些人源化单域抗体-fc融合蛋白。

20、有益效果：

21、本发明通过动物免疫和噬菌体展示技术，筛选获得了具有高亲和力的抗igf1r单域抗体，能够阻断igf1r与其配体igf1或igf2的结合，可能在更低剂量条件下，效果优于teprotumumab的预期临床疗效。

技术特征：

1.一组igf1r单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包括3个独特序列，相对应的克隆号为1d7、3b9和3g6，均由cdr区和可变区组成。

2.根据权利要求1所述的一组igf1r单域抗体，其特征在于，所述独特序列1d7中cdr区的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示，可变区的氨基酸序列为seq id no.10。

3.根据权利要求1所述的一组igf1r单域抗体，其特征在于，所述独特序列3b9中cdr区的氨基酸序列分别如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示，可变区的氨基酸序列为seq id no.11。

4.根据权利要求1所述的一组igf1r单域抗体，其特征在于，所述独特序列3g6中cdr区的氨基酸序列分别如seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9所示，可变区的氨基酸序列为seq id no.12。

5.一种融合蛋白，其特征在于，将权利要求1所述的igf1r单域抗体与人igg1 fc，即vhh的c端与人fc铰链区n端直接相连的核酸序列的pcdna3.1重组载体得到单域抗体-fc融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述人igg1 fc区域序列如seqid no.13所示；单域抗体-fc融合蛋白序列如seq id no.14、seq id no.15和seq id no.16所示。

7.人源后的igf1r单域抗体，其特征在于，将权利要求1所述的单域抗体3b9的可变区进行人源化改造得到8个人源化的抗体3b9-hz1，可变区；3b9-hz2，可变区；3b9-hz3，可变区；3b9-hz4，可变区；3b9-hz5，可变区；3b9-hz6，可变区；3b9-hz7，可变区；和3b9-hz8，可变区；其氨基酸序列分别如seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20、seq idno.21、seq id no.22、seq id no.23和seq id no.24所示。

8.权利要求1所述的igf1r单域抗体、权利要求5所述的融合蛋白以及权利要求7所述的人源后的igf1r单域抗体在igf1r过度表达诱发的相关疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的权利要求1所述的igf1r单域抗体、权利要求5所述的融合蛋白以及权利要求7所述的人源后的igf1r单域抗体在igf1r过度表达诱发的相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述相关疾病包括甲状腺眼病等。

技术总结
本发明涉及抗IGF1R单域抗体及其融合蛋白和人源化单域抗体的制备及应用。单域抗体包括3个独特序列，相对应的克隆号为1D7、3B9和3G6，均由CDR区和可变区组成；1D7的CDR区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。3B9的CDR区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11；3G6的CDR区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12。本发明筛选得到一组高亲和力的和具有生物功能抑制活性的抗IGF1R单域抗体，能完全阻断IGF1R和IGF1的结合，同时也能阻断IGF1R和IGF2的结合能特异性结合。

技术研发人员：李小川,张枢,段小群
受保护的技术使用者：苏州旭辉生物医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13