一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体及其分离方法与应用与流程

本申请属于微生物，具体涉及一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体及其分离方法与应用。

背景技术：

1、福氏志贺氏菌是一种禽类常见病原菌，可经垂直传播方式传染给下一代。家禽感染福氏志贺氏菌后，会出现腹泻等症状，导致生长受阻、产蛋量下降，甚至死亡，给养禽业带来极大的经济损失。目前，针对沙门菌病的防控主要依靠抗生素，长期大量使用抗生素也导致出现福氏志贺氏菌耐药性菌株增多现象，兽医临床上正面临无药可用的严峻形势，因此，寻找抗生素的替代品或研究疾病的生物防控方法便成为当前细菌性疾病防控函待解决的问题。噬菌体具有杀菌效果强、利用率高、特异性高、不受细菌耐药性限制等优点。

2、有鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

1、为了解决上述技术缺陷之一，本申请实施例中提供了一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体，在70℃高温条件下作用50min，其效价仍然能达到1*106，对温度有较好的耐受性；可以有效高效感染福氏志贺氏菌；旨在代替抗生素用于治疗和防控福氏志贺氏菌引起的疾病。

2、根据本申请实施例第一个方面，提供了一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体，命名为福氏志贺氏菌噬菌体pgsh-20417，于2022年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45260，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

3、根据本申请实施例提供的第二个方面，提供一种解聚酶，由上述福氏志贺氏菌噬菌体分泌表达。进一步的，福氏志贺氏菌噬菌体的dna序列序列如seq id no.1；解聚酶的dna序列如seq id no.2；解聚酶的氨基酸序列如seq id no.3。

4、根据本申请实施例提供的第三个方面，提供一种分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体在如下(1)-(4)任一项的应用：

5、(1)用于制备预防和或治疗性家禽福氏志贺氏菌引起的疾病的药物；

6、(2)用于生产预防和或治疗性家禽福氏志贺氏菌引起的疾病的添加剂；

7、(3)用于制备家禽养殖环境控制福氏志贺氏菌的清洁剂或者消毒剂；

8、(4)用于在饮水、饲料和环境中对福氏志贺氏菌的控制。

9、根据本申请实施例提供的第四个方面，提供一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法，包括以下步骤：

10、(1)福氏志贺氏菌噬菌体的分离：污水过滤得到滤液，与对数期宿主菌菌悬液一起加入lb液体培养基中，并置于培养箱中培养，培养后过滤后的滤液即为福氏志贺氏菌噬菌体原液；然后通过双平板法培养出噬菌斑；

11、(2)福氏志贺氏菌噬菌体的纯化：

12、从步骤(1)中出现噬菌斑的双层平板挑取单个噬菌斑，置于pbs缓冲液中培养后取上清液过滤，将过滤后的滤液通过双层平板培养，重复上述步骤至双层平板上噬菌斑大小、形态和清晰度一致时获得纯化的福氏志贺氏菌噬菌体。

13、进一步的，福氏志贺氏菌噬菌体的分离，包括如下步骤：

14、(1.1)取污水、离心、初步过滤除去较大杂质及大部分细菌后，再用微孔滤膜过滤除菌得到滤液a；

15、(1.2)将滤液a和等体积对数期宿主菌菌悬液，一起加入高压灭菌后的lb液体培养基中，然后置于培养箱中培养，培养后过滤得到滤液b；

16、(1.3)通过双平板法培养至出现噬菌斑。

17、进一步的，培养箱中培养的条件为：37℃恒温摇床培养箱中，培养10-12小时。

18、进一步的，福氏志贺氏菌噬菌体的纯化，包括如下步骤：

19、(2.1)从步骤(1)中出现噬菌斑的双层平板挑取单个独立、形态均匀、清晰透明的噬菌斑，置于pbs缓冲液，并用无菌接种环将其粉碎，浸泡后取上清液用微孔滤膜过滤，然后将滤液进行稀释；

20、(2.2)将步骤(2.1)稀释后的滤液与宿主菌悬液铺设于双层平板，重复上述步骤3-5次至双层平板上噬菌斑大小、形态和清晰度一致时获得纯化的福氏志贺氏菌噬菌体。

21、进一步的，微孔滤膜为0.22um微孔滤膜。

22、本申请的有益效果：

23、1.本申请从奶牛发酵床垫料环境中分离得到一株裂解性福氏志贺氏菌噬菌体，该噬菌体命名为福氏志贺氏菌噬菌体pgsm-20417，对环境中致病性沙门氏菌sa-20417具有强裂解作用，在防控福氏志贺氏菌引起的疾病中具有良好的应用前景；本申请提供的福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法为规模化生产噬菌体提供来源；本申请还提供了福氏志贺氏菌pgsm-20417在制备预防和或治疗福氏志贺氏菌引起的疾病的用途。

24、2.本申请所提供的福氏志贺氏菌噬菌体，能分泌解聚酶且耐高温，能广泛应用在家禽致病性福氏志贺氏菌噬菌体感染中以及在饮水、饲料和环境中对福氏志贺氏菌噬菌体进行控制；对温度具有较好的耐受性，有利于长期保存；效价较高，防治效果好。

25、3.本发明提供的福氏志贺氏菌噬菌体，所述噬菌体的基因组的第12位开放阅读框编码解聚酶。沙福氏志贺氏菌噬菌体通过编码由735个氨基酸组成的解聚酶；该解聚酶具有降解生物被膜的特性。

技术特征：

1.一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体，命名为福氏志贺氏菌噬菌体pgsh-20417，于2022年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45260，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.一种解聚酶，其特征在于，由权利要求1所述的福氏志贺氏菌噬菌体分泌表达。

3.如权利要求2所述的解聚酶，其特征在于，福氏志贺氏菌噬菌体的dna序列序列如seqid no.1；解聚酶的dna序列如seq id no.2；解聚酶的氨基酸序列如seq id no.3。

4.权利要求1所述的能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体在如下(1)-(4)任一项的应用：

5.一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法，其特征在于，福氏志贺氏菌噬菌体的分离，包括如下步骤：

7.如权利要求6所述的福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法，其特征在于，培养箱中培养的条件为：37℃恒温摇床培养箱中，培养10-12小时。

8.如权利要求5所述的福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法，其特征在于，氏志贺氏菌噬菌体的纯化，包括如下步骤：

9.如权利要求7所述的福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法，其特征在于，微孔滤膜为0.22um微孔滤膜。

技术总结
本申请提供一种能分泌解聚酶且耐高温的烈性福氏志贺氏菌噬菌体，命名为福氏志贺氏菌噬菌体PGSH‑20417，于2022年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45260，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本申请提供的福氏志贺氏菌噬菌体的分离方法为规模化生产噬菌体提供来源；本申请还提供了福氏志贺氏菌PGSM‑20417在制备预防和或治疗福氏志贺氏菌引起的疾病的用途。

技术研发人员：郝小静,张炜,衣服德,于江,代永联,成子强,王君玮,刘玉庆,刘华伟,何孟莲,孙京新,白光烨,李贵阳
受保护的技术使用者：青岛市畜牧工作站（青岛市畜牧兽医研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12