一种雌性达氏鲟特异的DNA片段DSX和鉴定达氏鲟性别的方法与流程

本发明涉及一种雌性达氏鲟特异的dna片段dsx和鉴定达氏鲟性别的方法，属于动物分子遗传学领域。

背景技术：

1、长江鲟又称达氏鲟是我国长江上游特有品种，在研究地球气候变化和鱼类演化等方面具有重要的科学价值。近年来，由于过度捕捞、环境污染等原因，长江鲟的资源急剧减少，已成为极危级(cr)物种，濒临灭绝。因此，如何保护长江鲟资源显得十分迫切和必要。

2、大多数脊椎动物为雌雄异体，且在形态和生理上体现出明显的性别二态性。性别是决定两性生殖繁殖的关键环节。随着分子生物学的发展，多种类型的性别标记被开发出来，包括微卫星标记、单核苷酸多态性、随机扩增多态性dna和限制性片段长度多态性。性别特异分子标记的开发应用和性别决定基因的鉴定一方面可以提高与性别相关的经济性状，为实现性控育种提供必要的工具；另一方面也为阐明鱼类性别决定的分子机理奠定基础。性别分子标记是开发性别控制技术的重要工具。本发明提供了一种鉴定达氏鲟性别的分子标记，和配合该标记同时使用的内参标记。使用本方法可以准确无误的鉴定达氏鲟性别。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于达氏鲟雌雄鉴定的雌性达氏鲟序列及其应用。

2、一种雌性达氏鲟特异的dna片段dsx，其特征在于，雌性达氏鲟特异的片段dsx为seq id no:1所示核苷酸序列。

3、一种雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考dna片段，所述雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考dna片段为seq id no:2为所示核苷酸序列，配合雌性达氏鲟特异的片段dsx鉴定达氏鲟的雌雄。

4、seq id no:1所示核苷酸序列和seq id no:2所示核苷酸序列应用于鉴定达氏鲟的性别。

5、所述的序列seq id no:1所示核苷酸序列，为雌性达氏鲟基因组特异性片段dsx。具体片段为：

6、cctgctattacaccgctcttgacatttttaatggtttctggtctctgccagtgaaaccagaatcacgctataaatttggtttcacttttggcgatacacagtatacctggaataaaattccgcaagggttccacaactctcccacgctctttcaccaaatactttctgaaattttgtcctgcttctctaaaccccaatgtttaatacattatgtcgatgacttactgacagacactcaaaggaggagcatctctcactgctggatgagctgttgacaacaacagagaatgcaggactcaatctgaacccaaaaaagcacaactaatgcaaccttctgttacttttctaggggtactcattgaggaaggaggacggtccccagacaaacacaaagtggaaactgtacagtggctgcctgtgccaacctctgaaaactgctttacgttcctttctaggtctggtcaatttttgttgtgagtttgaggacttttcatccaaggctaaaccactttatgatctgttgaaaggttccaggaaaggcaaggatgtgttggtatgggaaagcaa

7、所述的在雌雄基因组dna均可扩增出的阳性参考dna片段r4r12序列(seq id no:2)为：

8、ggacatgccccacaaaactgttccacttcttgatatattcctatccaataaaaccttttttaaatgtgttcccttgttttctgaactcccaattgtccctctaaaaaatgaccatgggctagtttcaaaactgttgttttatacttccttggg

9、一种雌性达氏鲟特异的dna片段dsx和鉴定达氏鲟性别的方法具体引物信息如下表1：

10、表1

11、

12、r7r11f、r7r11r序列为seq id no:1所示核苷酸序列引物，利用该引物在雌性达氏鲟可扩出阳性片段，但在雄性达氏鲟上扩不出阳性片段；

13、r4r12f、r4r12r序列为seq id no:2所示核苷酸序列引物，利用该对引物在雌性和雄性达氏鲟上均可扩出阳性片段。

14、一种雌性达氏鲟特异的dna片段dsx和鉴定达氏鲟性别的方法进行判断达氏鲟雌雄是基于所述扩增片段的长度大小或片段序列。当扩增结果为567bp和153bp，或者扩增结果的序列为seq id no:1和seq id no:2所示核苷酸序列，则所测达氏鲟性别为雌性。当扩增结果仅为153bp，或者扩增结果的序列仅为seq id no:2所示核苷酸序列，则所测达氏鲟性别为雄性。

15、所述鉴定达氏鲟雌雄的具体方法为：提取待鉴定达氏鲟dna；利用所示的引物对样品进行pcr扩增；把pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳30分钟进行分离，具体电压为120v；根据分离结果统计pcr扩增产物的条带大小。本发明所述的pcr扩增体系是25ul：10×pcr buffer 3ul，2.5mmol/l dntp 2ul，mgcl2 3ul，上下游引物各1ul，taq酶0.5ul，dna模板2ul，超纯水10.5ul。本发明所述的pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

16、使用本发明提供的序列可以准确鉴定达氏鲟雌雄，实施例进行了验证，与实际结果完全一致，准确度100％。

17、与现有技术相比，本发明具有以下的优点：

18、利用本发明可以快速准确的鉴定达氏鲟性别。利用本发明可以实现达氏鲟全雌化养殖，节省了养殖空间，合理利用达氏鲟养殖的人力、物力和财力。本方法可以无损伤鉴定达氏鲟的性别，相较于达氏鲟传统性别鉴定方法(b超法)，本方法不受年龄的限制，从受精卵到生命终结的整个生命周期都可以进行性别鉴定，而b超法鉴定达氏鲟的性别有年龄限制，b超法只能够鉴定5岁龄以上达氏鲟的性别。本鉴定方法相较于达氏鲟另一个传统性别鉴定方法(挖卵鉴定)更具有优势，挖卵鉴定法需要对3岁龄以上的达氏鲟进行剖腹和把卵挖出来一部分进行鉴定，挖卵鉴定法对达氏鲟会造成非常大的伤害。本方法避免了科研人员在实验操作过程出现的各种失误对实验结果造成误读的现象，比如提取dna失败、加错样品或者药剂都不会对本方法的实验结果造成偏差。

技术特征：

1.一种雌性达氏鲟特异的dna片段dsx，其特征在于，雌性达氏鲟特异的片段dsx为seqid no:1所示核苷酸序列。

2.一种雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考dna片段，其特征在于，所述雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考dna片段为seq id no:2为所示核苷酸序列，配合雌性达氏鲟特异的片段dsx鉴定达氏鲟的雌雄。

3.权利要求1中seq id no:1所示核苷酸序列和权利要求2中seq id no:2所示核苷酸序列应用于鉴定达氏鲟的性别。

4.一种鉴定达氏鲟性别的引物，其特征在于，包括用于达氏鲟雌雄鉴定的两对对引物：

5.权利要求4所述的引物在达氏鲟性别鉴定中应用。

6.一种鉴定达氏鲟性别的方法，其特征在于，对待测达氏鲟的基因组dna进行pcr扩增，当扩增结果为567bp和153bp，或者扩增结果的序列为seq id no:1和seq id no:2所示核苷酸序列，则所测达氏鲟性别为雌性；当扩增结果仅为153bp，或者扩增结果的序列仅为seqid no:2所示核苷酸序列，则所测达氏鲟性别为雄性。

7.根据权利要求6所述鉴定达氏鲟性别的方法，其特征在于，所述鉴定达氏鲟雌雄的具体方法为：提取待鉴定达氏鲟dna；利用权利要求4所示的引物对待测样品进行pcr扩增；把pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳30分钟进行分离，电压为120v；根据分离结果统计pcr扩增产物的条带大小。

8.根据权利要求7的鉴定达氏鲟性别的方法，其特征在于，pcr扩增体系是25ul：10×pcr buffer 3ul，2.5mmol/l dntp 2ul，mgcl2 3ul，上下游引物各1ul，taq酶0.5ul，dna模板2ul，超纯水10.5ul。

9.根据权利要求7的鉴定达氏鲟性别的方法，其特征在于，pcr扩增程序为： 94℃预变性3min; 94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环； 72℃延伸10min； 4℃保存。

技术总结
本发明公开了一种雌性达氏鲟特异的DNA片段DSX和鉴定达氏鲟性别的方法，属于动物分子遗传学领域。本发明公开了一段雌性达氏鲟序列，利用该序列可以进行达氏鲟的雌雄鉴定。本发明所述的引物为根据序列DSX设计而成，利用本引物对待测达氏鲟进行PCR扩增，当扩增结果片段为567bp或者扩增结果的序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列时，则待测达氏鲟为雌性，否则为雄性。进一步，本发明提供了一段达氏鲟内参序列进行配合达氏鲟特异的DNA片段DSX。本发明提供的达氏鲟序列片段可以快速有效鉴定达氏鲟雌雄。利用本方法可以有效提高达氏鲟养殖效率，进一步提高达氏鲟养殖合理性，人为调节养殖达氏鲟雌雄比例，更为合理的利用养殖达氏鲟的人力、物力和财力。

技术研发人员：朱欣,胡亚成,杨元金,杜合军,田甜,王京树,王威,田家元,李源,邬鹏,张德志
受保护的技术使用者：中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12