一种罗汉果醇的生物合成方法

本发明属于天然产物生物合成，具体涉及蜗牛酶催化罗汉果苷粗提物水解制备苷元罗汉果醇。通过构建双相酶促反应体系进一步提高了罗汉果醇的生物合成效率，简化了产品纯化程序，为基于罗汉果醇的药物开发提供了物质来源。

背景技术：

1、罗汉果醇是一种源自罗汉果(siraitia grosvenorii)的葫芦烷型四环三萜类化合物，罗汉果苷的苷元。研究显示，罗汉果醇具有抗癌、抗癌、抗病毒、抗肺纤维化、神经保护等多种生物活性(liu c,et al.future med.chem.,2018,10:845-850)。此外，罗汉果苷的活性研究显示，大多数罗汉果苷口服后，多以罗汉果醇的形式进行血液(xu f,etal.j.pharm.biomed.anal.,2015,115:418-430)。由此可见，罗汉果醇是一种极具开发价值和潜力的药物先导化合物。罗汉果苷生物合成途径的解析显示，罗汉果醇是生物合成糖单元数目各异，糖苷键多样罗汉果苷的前体(itkin m,et al.proc.natl.acad.sci.usa,2016,113:e7619-e7628)。

2、但是，罗汉果醇在罗汉果中的含量极少，规模化制备的难度大，成本高。除了从罗汉果中直接提取外，罗汉果苷的酸/碱水解是制备罗汉果醇的重要手段。不过，酸/碱水解反应的条件较为剧烈，有可能会破坏罗汉果醇的骨架结构，造成产物损失或产生难以预期的杂质(chen x,et al.bioorg.med.chem.,2011,19:5776-5781)。相比之下，酶催化反应更加温和，位置选择性强，有望克服酸/碱水解的缺点，成为罗汉果苷水解制备罗汉果醇的新方法。但由于生物酶有底物特异选择性，目前，尚无酶法彻底水解罗汉果苷制备罗汉果醇的方法报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：采用反应条件温和的糖苷酶建立一种罗汉果醇的生物合成新方法，大量获得高质量的罗汉果醇，解决其来源问题。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：

3、一种罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，利用糖苷酶催化罗汉果粗提物水解获得罗汉果醇，其中所用糖苷酶为果胶酶或蜗牛酶。

4、所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，利用有机试剂与反应缓冲液构建双相酶促反应体系，水解罗汉果提取物制备罗汉果醇；有机试剂选自甲基叔丁基醚或甲苯。

5、所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，缓冲液选自ph为4.0-7.0的缓冲液，缓冲液选自柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和醋酸钠-醋酸缓冲液。

6、所述的罗汉果醇的生物合成方法，，其特征在于，所述的双相酶促反应体系中采用蜗牛酶，蜗牛酶的用量为5mg/ml-15mg/ml；罗汉果提取物的浓度为10-20mg/ml；甲苯体积浓度为10％-70％v/v。

7、所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，所述的双相酶促反应体系的反应ph为4.0-7.0；反应温度为35℃-60℃；反应时间为0-24小时。

8、所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，其特征在于步骤包括：

9、将蜗牛酶和罗汉果提取物加至缓冲液，加入甲苯，混合均匀后，得双相反应体系；反应结束后，静置2h后，两相分离，收集甲苯层；水层用乙酸乙酯萃取；除去甲苯和乙酸乙酯，合并罗汉果醇粗提物；粗提物溶解于20％v/v乙醇溶液后利用聚酰胺树脂柱分离纯化，乙醇-水溶液梯度洗脱，合并收集含高纯度罗汉果醇得洗脱液，干燥后得罗汉果醇。

10、

11、有益效果

12、纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶，β-葡萄糖苷酶水解糖苷键的常见糖苷酶(li w,etal.molecules,2011,16:10093-10103)，其中蜗牛酶是一种由果胶酶、纤维素酶、淀粉酶和其他水解酶组成的混合酶。糖苷酶是水解糖苷键制备相应水解产物的重要酶类，但是每一种糖苷酶都存在较为严重的底物选择性。本发明在测试纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶，β-葡萄糖苷酶对罗汉果苷粗提物的水解效果后，比较并非所有的糖苷酶可以酶解罗汉果提取物获得单一产物，本发明首次发现只有蜗牛酶和果胶酶可水解罗汉果提取物获得罗汉果醇。

13、在水相反应体系中，蜗牛酶催化3mg/ml罗汉果提取物水解制备罗汉果醇的产率不足75％，从底物浓度和效率角度来看这无法满足规模化制备的需求。有机溶剂和反应缓冲液组成的双相反应体系是提高底物浓度和催化效率的手段之一，但是由于有机溶剂的存在常会导致酶的失活，在酶解反应中一般难以构建双相反应体系。鉴于罗汉果醇与罗汉果苷水溶性的差异，本发明筛选了多种有机溶剂，通过系统优化，将反应的底物浓度提升至15mg/ml，罗汉果醇的产率达到93.1％，基本满足了规模化制备。此外，罗汉果醇在有机溶剂中的高溶解度使产物的提取和纯化步骤得到了有效的简化。

14、因此，本发明具备如下优点：

15、1)在水相反应体系中，蜗牛酶催化合成罗汉果醇的效率较低，无法满足规模化制备需求，本发明构建的双相酶促反应体系合成罗汉果醇的效率更高，并且罗汉果醇在有机相中的高溶解度，进一步简化了分离纯化过程。

16、2)与酸/碱水解反应相比，本发明建立的蜗牛酶法制备罗汉果醇的方法，反应条件更加温和，避免了罗汉果醇的结构破坏，利于获得高质量产物。

17、3)本发明采用聚酰胺树脂纯化制备罗汉果醇，具有上样量大，可重复使用等优点，利于罗汉果醇的低成本规模化制备。

18、综上所述，以蜗牛酶为生物催化剂，本发明建立的罗汉果醇双相制备体系，对罗汉果醇和罗汉果苷的深度开发具有重要意义。

技术特征：

1.一种罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，利用糖苷酶催化罗汉果粗提物水解获得罗汉果醇，其中所用糖苷酶为果胶酶或蜗牛酶。

2.根据权利要求1所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，利用有机试剂与反应缓冲液构建双相酶促反应体系，水解罗汉果提取物制备罗汉果醇；有机试剂选自甲基叔丁基醚或甲苯。

3.根据权利要求2所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，缓冲液选自ph为4.0-7.0的缓冲液，缓冲液选自柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和醋酸钠-醋酸缓冲液。

4.根据权利要求2所述的罗汉果醇的生物合成方法，，其特征在于，所述的双相酶促反应体系中采用蜗牛酶，蜗牛酶的用量为5 mg/ml-15 mg/ml; 罗汉果提取物的浓度为10-20mg/ml；甲苯体积浓度为10%-70% v/v。

5.根据权利要求2所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，所述的双相酶促反应体系的反应ph为4.0-7.0；反应温度为35℃-60℃；反应时间为0-24小时。

6.根据权利要求2所述的罗汉果醇的生物合成方法，其特征在于，其特征在于步骤包括：

技术总结
本发明涉及一种罗汉果醇的生物合成方法；罗汉果醇是一种源自罗汉果（Siraitia grosvenorii）的葫芦烷型四环三萜类化合物，为罗汉果苷类化合物的苷元，具有抗癌、抗肺纤维化、神经保护等多种药理活性。但是，罗汉果醇在罗汉果中的含量极少，规模化制备的难度大，成本高。因此，本发明公开了一种以蜗牛酶为催化剂水解罗汉果苷粗提物制备罗汉果醇的生物催化新工艺，为解决罗汉果醇的来源难题提供了一种简便快捷方法。

技术研发人员：吴旭日,苏咏欣,赵莹慧,刘莹,陈依军
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12