一种沉默HS3ST5基因表达的shRNA及其重组慢病毒载体和应用

本发明属于基因沉默，具体涉及一种沉默hs3st5基因表达的shrna及其重组慢病毒载体和应用。

背景技术：

1、短发夹rna(shrna)是能够形成发夹结构的非编码小rna分子。shrna具有特殊的茎环结构，是常用的沉默基因的手段，能够长期、稳定的发挥rna干扰作用而不引起非特异性反应。shrna包含sirna正义链、loop序列、反义链和转录终止信号，将shrna连接在表达载体上，在rna聚合酶作用下产生含有小发夹结构的双链rna。shrna介导的rna干扰技术已经成为基因编辑中的有力工具，在基因治疗、药物研发、动物疾病模型、以及农业遗传育种等领域具有重要应用潜力。

2、由于病毒感染比转染方法传递核酸的效率更高，病毒载体向细胞内递送核酸成为高效的方法。常用的病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体等。慢病毒载体是一类改造自人免疫缺陷病毒(hiv)的病毒载体，属于假病毒，其毒性基因已被剔除并被外源基因替代。慢病毒载体在逆转录酶作用下可以将外源基因稳定整合到细胞基因组内，实现外源基因的稳定表达。慢病毒载体可以作为递送shrna进入细胞内的手段之一。携带shrna的慢病毒质粒转染细胞后能够包装出重组慢病毒，重组慢病毒感染细胞后将shrna整合到细胞基因组中，通过抗生素压力筛选或荧光激活的细胞分选能够筛选出稳定整合shrna的重组细胞，从而长期在细胞内转录shrna，产生稳定沉默靶基因的效果。

3、利用shrna沉默宿主细胞内有利于病毒感染的蛋白基因可作为一种新型的抗病毒策略。

4、硫酸乙酰肝素(hs)广泛表达于大多数动物组织的细胞表面和细胞外基质中，以硫酸乙酰肝素蛋白多糖(hspg)的形式存在。许多病原体通过hs结合到细胞表面，从而感染宿主细胞。硫酸乙酰肝素3-o-硫酸基转移酶(hs3st)家族蛋白参与hs合成过程中硫酸化修饰的最后一步，是hs生物合成的关键酶。hs3st家族蛋白包括7个异构体，其中hs3st5的生物活性最强。hs3st5等hs3st异构体能够在多种组织和同一组织的不同发育阶段控制配体结合、信号转导和病原微生物感染等，影响宿主细胞的稳态和病原微生物的感染进程。近年来，hs3st5独特的底物特异性和特殊的修饰位点使其在hs生物合成和功能研究中越来越受到重视。hs于1996年被证实可以作为替代受体被口蹄疫病毒(fmdv)利用而感染细胞，目前还不清楚hs3st5对fmdv复制的影响。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种沉默hs3st5基因表达的shrna，能有效沉默hs3st5基因的表达，为抑制fmdv的增殖奠定基础。

2、本发明提供了一种沉默hs3st5基因表达的shrna，所述shrna的核苷酸序列如seqid no:1和/或seq id no:3所示。

3、本发明提供了一种含shrna的重组慢病毒质粒，所述shrna为所述shrna。

4、优选的，所述重组慢病毒质粒的骨架质粒为plko.1载体。

5、本发明提供了一种重组慢病毒，由所述重组慢病毒质粒和辅助质粒拯救得到。

6、优选的，所述辅助质粒包括pspax2辅助质粒和pmd2.g辅助质粒；

7、所述拯救的方法为在转染试剂的作用下将重组慢病毒质粒、pspax2辅助质粒、pmd2.g辅助质粒进行共转染；

8、所述重组慢病毒质粒、pspax2辅助质粒、pmd2.g辅助质粒的质量比为4:3:1。

9、本发明提供了所述shrna、所述重组慢病毒质粒或所述重组慢病毒在降低细胞中hs3st5基因表达中应用。

10、本发明提供了一种敲降细胞中hs3st5基因的试剂在制备降低病毒增殖的细胞或制备抗病毒感染的药物中的应用。

11、优选的，所述试剂包括以下一种或几种：所述shrna、所述重组慢病毒质粒或所述重组慢病毒；

12、所述病毒包括利用hs受体入侵细胞的病毒。

13、本发明提供了一种抗病毒感染的药物，以所述shrna、所述重组慢病毒载体或所述重组慢病毒为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。

14、本发明提供了一种基于所述shrna介导的稳定敲降hs3st5基因的重组bhk-21细胞系。

15、本发明提供了所述重组bhk-21细胞系在抵抗病毒感染的材料中的应用。

16、本发明提供了一种沉默hs3st5基因表达的shrna，核苷酸序列如seq id no:1和/或seq id no:3所示。本发明设计出的shrna具有良好靶向沉默细胞hs3st5基因表达的作用。实验表明，shrna以重组慢病毒载体形式包装成重组慢病毒，感染细胞后，成功建立敲除hs3st5基因的重组bhk-21细胞系，与空白对照组和空载体组相比，重组bhk-21细胞系中hs3st5基因或蛋白的表达量显著降低，以本发明保护的shrna敲除细胞，获得显著降低的重组bhk-21细胞系(bhk-shhs3st5-807-2-kd和/或bhk-shhs3st5-954-47-kd)。可见，本发明提供的shrna具有较强的沉默hs3st5基因表达的功能。

17、本发明提供了一种敲降细胞中hs3st5基因的试剂在制备降低病毒增殖的细胞中的应用。本发明将病毒然然敲降hs3st5的细胞，通过检测细胞中病毒蚀斑数量评估子代病毒形成情况，结果表明与对照细胞相比，shrna-807敲降hs3st5的bhk-21重组细胞系中的蚀斑数目降低40％，shrna-954敲降hs3st5的bhk-21重组细胞系中的蚀斑数目降低38％。可见本发明首次证明敲降hs3st5的bhk-21重组细胞显著抑制病毒的感染，为抗病毒感染药物提供了有效靶点，同时为抗病毒感染提供新思路。

技术特征：

1.一种沉默hs3st5基因表达的shrna，其特征在于，所述shrna的核苷酸序列如seq idno:1和/或seq id no:3所示。

2.一种含shrna的重组慢病毒质粒，其特征在于，所述shrna为权利要求1所述shrna。

3.根据权利要求2所述重组慢病毒质粒，其特征在于，所述重组慢病毒质粒的骨架质粒为plko.1载体。

4.一种重组慢病毒，其特征在于，由权利要求2或3所述重组慢病毒质粒和辅助质粒拯救得到。

5.权利要求1所述shrna、权利要求2或3所述重组慢病毒质粒或权利要求4所述重组慢病毒在降低细胞中hs3st5基因表达中应用。

6.一种敲降细胞中hs3st5基因的试剂在制备降低病毒增殖的细胞或制备抗病毒感染的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述试剂包括以下一种或几种：权利要求1所述shrna、权利要求2或3所述重组慢病毒质粒或权利要求4所述重组慢病毒；

8.一种抗病毒感染的药物，其特征在于，以权利要求1所述shrna、权利要求2或3所述重组慢病毒载体或权利要求4或5所述重组慢病毒为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。

9.一种基于权利要求1所述shrna介导的稳定敲降hs3st5基因的重组bhk-21细胞系。

10.权利要求9所述重组bhk-21细胞系在抵抗病毒感染的材料中的应用。

技术总结
本发明提供了一种沉默HS3ST5基因表达的shRNA及其重组慢病毒载体和应用，属于基因沉默技术领域。本发明设计2种沉默HS3ST5基因表达的shRNA，并构建携带所述shRNA的重组慢病毒质粒，利用包装出重组慢病毒建立了敲降HS3ST5的重组BHK‑21细胞系，结果表明，敲降HS3ST5表达水平能有效抑制病毒的增殖。可见，本发明为抗病毒感染提供了新思路。

技术研发人员：袁红,白兴文,卢曾军,黄磊,宫晓华,刘在新,孙普,李平花,包慧芳,李冬,马雪青,陈应理,曹轶梅,付元芳,赵志荀,张婧,王健
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13