一种用于制备两碱基重复STR的等位基因分型标准物的方法与流程

本发明属于生物，特别是涉及一种用于制备两碱基重复str的等位基因分型标准物(allele ladder)的方法。

背景技术：

1、等位基因分型标准物(allele ladder)是某一str遗传标记在人或动物群体中常见的等位基因的混合物。它们和检测样本使用相同的引物，为每一个等位基因提供dna片段大小参照物。因此，等位基因ladder对精准的基因分型十分重要。

2、在各种类型的str遗传标记中，动物基因组(如猫、牛、牛等)中核心重复区多为两碱基重复，由于两碱基重复stutter比例较高，相关的等位基因分型标准物(alleleladder)一直没有合理的制备方法，为相关检测和鉴定增加了难度的同时，对结果的准确性也存有一定质疑。因此，解决两碱基重复ladder制备对动物检测和人的部分str遗传标记十分必要。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中多重str两碱基重复等位基因分型标准物制备中存在的问题，本发明提供了一种全新的等位基因分型标准物的制备方法，主要针对str中两碱基重复的遗传标记位点。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种用于制备两碱基重复str的等位基因分型标准物(allele ladder)的方法，包括如下步骤：

3、(1)根据str基因座的重复数在重复区适当插入碱基，合成质粒；

4、(2)根据str基因座序列设计并合成引物对；

5、(3)以合成质粒作为模板，使用引物对进行pcr扩增反应，得到的扩增产物即为相应的str基因座的allele ladder中一个分型。

6、所述的重复区重复数超过15个重复(低于15个重复stutter比例一般小于20％)。

7、所述的适当插入碱基为两碱基重复每隔6个重复插入一个碱基。

8、所述的引物对引物范围在重复区前后，正向引物f的5’端采用荧光素修饰，反向引物r5'末尾添加三碱基修饰。

9、所述三碱基修饰为att，所述荧光素修饰为fam、hex、joe、vic、ned、tamra、rox等。

10、所述的插入的碱基为重复区重复碱基拆开分别插入适当位置，可保持最终重复数和片段长度不变。

11、所述的pcr扩增程序为95℃5min，1个循环；94℃30s、60℃35s、70℃45s，35个循环；60℃60min，1个循环。

12、进一步的，正向扩增引物f和反向扩增引r的序列分别为：

13、f＝gaacctgcctctcctgcattgg(seq id no.1)；

14、r＝attactagcctgtggccaagtagg(seq id no.2)。

15、进一步的，pcr扩增体系为：

16、

17、进一步的，质粒合成后，采用te缓冲液稀释到0.05ng，作为pcr扩增的模板。

18、有益效果

19、1)采用本发明的方案进行allele ladder制备，首次解决了由于stutter比例过高，两碱基重复ladder无法制备的问题，为核心重复区为两碱基的遗传标记分型准确性的判断提供了依据，能够极大地提高两碱基重复基因座分型判断的准确性。

20、2)采用本发明的方案进行allele ladder制备，所得到的等位基因片段与传统方法得到的相同等位基因片段的长度相等或接近(偏差小于0.1bp)，核心重复单元碱基构成一致，其差异仅在于核心重复结构域的碱基排布，而这一差别并不影响相同等位基因片段在毛细管电泳时电泳长度呈现。

21、3)采用本发明的方案进行allele ladder制备，解决了现有一部分亲权鉴定试剂盒中无法提供allele ladder作为准确分型判断标准的问题，完善了其试剂盒组分。

技术特征：

1.一种用于制备两碱基重复str的等位基因分型标准物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的在重复区重复数超过15个重复。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的插入碱基为两碱基重复每隔6个重复插入一个碱基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物对引物范围在重复区前后，正向引物f的5’端采用荧光素修饰，反向引物r的5'末尾添加三碱基修饰。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光素为fam、hex、joe、vic、ned、tamra或rox，所述三碱基为att。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，插入的碱基为重复区重复碱基拆开分别插入适当位置，保持最终重复数和片段长度不变。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增程序为95℃5min，1个循环；94℃30s、60℃35s、70℃45s，35个循环；60℃60min，1个循环。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，正向扩增引物f和反向扩增引r的序列分别为：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，pcr扩增体系为：

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质粒合成后，采用te缓冲液稀释到0.05ng，作为pcr扩增的模板。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种用于制备两碱基重复STR的等位基因分型标准物(allele ladder)的方法，其包括以下步骤：(1)根据STR基因座的重复数在重复区适当插入碱基，合成质粒；(2)根据STR基因座序列设计并合成引物对；(3)以合成质粒作为模板，使用引物对进行PCR扩增反应，得到的扩增产物即为相应的STR基因座的alleleladder中一个分型。本发明解决了两碱基重复STR由于stutter比例过大无法制作ladder的问题，能够极大地提高两碱基重复基因座分型判断的准确性。

技术研发人员：高知枭,于在亮,郭萌,陈初光
受保护的技术使用者：苏州阅微基因技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11