一种油菜RNA加工因子NCBP基因及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种油菜rna加工因子ncbp基因及其应用。

背景技术：

1、甘蓝型油菜(brassica napusl.，2n＝38,aacc)是世界上最重要的食用植物油资源之一，油菜粕也是饲料蛋白的重要来源，与畜牧业的发展息息相关。因此，大力发展油菜产业，对于保障我国优质食用植物油和饲料蛋白的有效供应，促进相关产业发展具有重要意义。

2、开花是植物从营养阶段向生殖阶段转变的过程，这个过程受内部因素(年龄和赤霉素)和外部环境条件(光周期、春化和环境温度)的综合调控。油菜生育期对产量有显着影响，开花时间是影响生育期的重要因素。不同生态区域对油菜品种的开花期要求不同，油菜花期的长短也决定了其种植面积，植物适时开花可以避免不适宜的生存环境，对提高植物产量具有重要意义。挖掘油菜花期调控基因，对于维护国家食用油供应、保障国家粮油安全具有重要的战略意义和实际应用价值。

3、鉴于此，本发明利用gwas技术，分离了一个位于甘蓝型油菜10号染色体上，同时控制初花期、终花期和成熟期的qtl，s10_12378911，进一步在该区间内发现候选基因ncbp.a10，其编码一种rna加工因子。通过对候选基因进行crispr/cas9基因编辑验证，并将其过表达载体在拟南芥中异源表达，证实了该基因在控制开花时间上的生物学功能，可为利用该基因进行花期的遗传改良提供理论依据。。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种通过crispr-cas9技术对油菜ncbp基因家族进行基因编辑的方法，以提供一种可调节植物开花时间的基因，为培育生育期适当的油菜品种提供依据。

2、本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

3、本发明提供了一种油菜rna加工因子ncbp基因，该基因位于油菜的a10染色体上，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，或具有与seq id no.1所示序列互补的核苷酸序列。

4、本发明还提供了一种上述油菜rna加工因子ncbp基因在改良油菜花期性状中的应用。

5、进一步改进在于，所述油菜为甘蓝型油菜。

6、进一步改进在于，敲除甘蓝型油菜中ncbp基因的纯合突变体植株表现出晚花。

7、进一步改进在于，过表达甘蓝型油菜中ncbp基因的纯合植株表现出早花。

8、本发明还提供了一种改良油菜花期性状的方法，包括以下步骤：

9、(1)在油菜bnancbp基因家族编码区的保守区域设计靶标序列；

10、(2)根据靶标序列合成接头引物，构建用于bnancbp基因打靶的crispr/cas9重组载体；

11、(3)将所述重组载体转入根癌农杆菌gv3101,利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜春性品种westar,获得转基因油菜植株；

12、(4)提取转基因阳性植株基因组dna，利用覆盖靶标位点的基因特异性引物进行pcr扩增和序列测序，对t0代转基因植株进行基因型鉴定；

13、(5)对发生基因编辑的突变体在t1代进行种植，利用引物对t1代植株中的hpt和cas9转基因进行pcr扩增检测，获得纯合的bnancbp基因编辑突变体植株。

14、进一步改进在于，所述靶标序列包括以下三种：

15、sgrna1：5‘-tgcagtacaagtttgcgatttgg-3’；

16、sgrna2：5‘-tcgcaatgcttctgatcatcagg-3’；

17、sgrna3：5‘-tactctcgcgacctcaaagctgg-3’。

18、进一步改进在于，所述步骤(5)中，用于hpt和cas9转基因扩增的引物序列分别为：

19、hpt-f：5'-acactacatggcgtgatttcat-3'；

20、hpt-r：5'-tccactatcggcgagtacttct-3'；

21、cas9-f：5'-ggcctcgatattgggactaact-3'；

22、cas9-r：5'-gtccgccttatctgtggagt-3'。

23、本发明还提供了一种油菜rna加工因子ncbp基因的获得方法，以ncbp基因的核苷酸序列为模板设计特异性扩增引物，以野生型westar油菜品种为材料，提取rna并反转录成cdna，通过pcr扩增技术获得油菜ncbp基因。

24、进一步改进在于，所述pcr扩增的特异性扩增引物为：

25、bnancbp.a10-f：5'-ggatccatggagattacggagaggaggc-3’；

26、bnancbp.a10-r：5'-gtcgactcctctcagccaagtgttcc-3’。

27、本发明提具有如下有益效果：

28、1.本发明利用甘蓝型油菜自然群体根据gwas分析结果，在a10染色体上定位了一个同时控制多个生育期性状的稳定主效qtl—s10_12378911，对定位区间进行基因注释及候选基因分析筛选到一个候选基因ncbp，所述ncbp基因编码一个rna加工因子。

29、2.本发明通过crispr-cas9技术对bnancbp基因家族进行基因编辑，t2代共获得4种纯合突变基因型。盆栽实验表明，纯合突变体开花时间比野生型显著延迟。进一步将bnancbp.a10过表达载体转化拟南芥，转基因纯合植株表现出早花，证实了ncbp基因可以控制花期。因此，ncbp基因有利于甘蓝型油菜花期性状的遗传改良和分子育种。利用该方法可快速定向改良现有油菜品种，大大缩短育种周期，节约时间和成本。

技术特征：

1.一种油菜rna加工因子ncbp基因，其特征在于，该基因位于油菜的a10染色体上，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，或具有与seq id no.1所示序列互补的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述的油菜rna加工因子ncbp基因在改良油菜花期性状中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述油菜为甘蓝型油菜。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，敲除甘蓝型油菜中ncbp基因的纯合突变体植株表现出晚花。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，过表达ncbp基因使得转基因拟南芥表现出早花。

6.一种改良油菜花期性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的改良油菜花期性状的方法，其特征在于，所述靶标序列包括以下三种：

8.根据权利要求6所述的改良油菜花期性状的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，用于hpt和cas9转基因扩增的引物序列分别为：

9.一种油菜rna加工因子ncbp基因的获得方法，其特征在于，以ncbp基因的核苷酸序列为模板设计特异性扩增引物，以野生型westar油菜品种为材料，提取rna并反转录成cdna，通过pcr扩增技术获得油菜ncbp基因。

10.根据权利要求9所述的一种油菜rna加工因子ncbp基因的获得方法，其特征在于，所述pcr扩增的特异性扩增引物为：

技术总结
本发明公开了一种油菜RNA加工因子NCBP基因及其应用，涉及基因工程技术领域，该基因位于油菜的A10染色体上，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ IDNO.1所示序列互补的核苷酸序列。本发明首次公开NCBP基因在调控植物花期中的用途，通过CRISPR‑Cas9技术遗传转化甘蓝型油菜品种Westar对油菜NCBP基因家族进行基因编辑，进一步筛选获得含有目的基因突变的纯合突变体材料，突变体材料表现出晚花，NCBP.A10在拟南芥中的过表达表现出早花，证实了NCBP基因在油菜花期调控中的用途。本发明为培养生育期适当的甘蓝型油菜提供了新的基因资源和新思路。

技术研发人员：王腾岳,李培金,刘继芳,陶珍,王传宏
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13