一种从干细胞采集物中分离提取CD34+干细胞的方法及用途与流程

本发明涉及生物医药。具体地，涉及一种从干细胞采集物中分离提取cd34+干细胞的方法及用途。

背景技术：

1、造血干细胞又称多能干细胞，是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，并最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板等。造血干细胞用途广泛，除了重建造血和免疫系统，还可以向非血细胞，如肝脏细胞、脑的星形胶质和少突胶质细胞、肌肉前体细胞、心肌细胞、毛细血管、以及小动脉中的内皮细胞和平滑肌细胞分化。

2、体外造血干细胞扩增培养是干细胞研究的热点。少量健康的造血干细胞可经诱导分化成血小板，红细胞和各种免疫细胞，用于造血移植、输血，癌症和自身免疫病等的治疗研究。

3、成人造血干细胞主要存在于扁平骨的红骨髓中，成人的红骨髓约3000g，一般以大量表达cd34造血细胞作为造血干细胞的标志。除骨髓外，正常人体的外周血中也含有少量造血干细胞。用“动员剂”动员骨髓中的造血干细胞，使其释放到外周血中，可从外周血获得造血干细胞。动员剂可使外周血中的cd34+的细胞数量增加20～30倍。除了骨髓和外周血动员，造血干细胞的另一重要来源为脐血。足月胎儿在分娩时，造血干细胞还处于从胎肝向骨髓转移的过程中，因此脐血中会含有一定量的造血干细胞。一份100ml的脐血含cd34+的细胞为40-200万个。

4、由于脐血较容易获取，体外研究中干细胞多来源于脐血。但通常需要收集上百毫升但脐血才可获得百万级的cd34+数目，操作繁琐。

5、因此，本领域需要开发一种从干细胞采集物中分离提取cd34+干细胞的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种从干细胞采集物中分离提取cd34+干细胞的方法及用途。

2、在本发明的第一方面，提供了一种从原本废弃的标本获得树突状细胞的方法，包括以下步骤：

3、(a)提供一原本废弃的标本，体积为0.2ml-1.5ml；

4、(b)从原本废弃的标本中分选获得cd34+干细胞，其中，目标cd34+干细胞的活细胞比例≥80％，目标cd34+干细胞的纯度≥85％，目标cd34+干细胞为cd45dim/+cd34+sslowfslow型细胞；

5、(c)在扩增条件下，对所述cd34+干细胞进行悬浮培养，悬浮培养的时间为tc，获得经扩增的细胞群；和

6、(d)在分化条件下，对所述经扩增的细胞群进行诱导培养，诱导培养的时间为td，获得树突状细胞；

7、其中，悬浮培养的时间tc和诱导培养的时间td(tc+td)为21-35天。

8、在另一优选例中，在步骤(a)中，所述体积为0.3ml-0.8ml。

9、在另一优选例中，在步骤(a)中，所述原本废弃的标本来源于健康干细胞供者的干细胞采集物。

10、在另一优选例中，在步骤(a)中，所述原本废弃的标本来源于外周血造血干细胞采集物。

11、在另一优选例中，在步骤(b)中，平均0.5ml体积的废弃的标本获得0.5-1×106cd34+干细胞。

12、在另一优选例中，在步骤(b)中，所述目标cd34+干细胞的活细胞比例较佳地≥85％，更佳地≥90％。

13、在另一优选例中，在步骤(b)中，所述目标cd34+干细胞的活细胞比例为85-95％。

14、在另一优选例中，在步骤(b)中，所述目标cd34+干细胞的纯度较佳地≥90％，更佳地≥95％。

15、在另一优选例中，在步骤(b)中，所述目标cd34+干细胞的纯度为85％-98％。

16、在另一优选例中，在步骤(b)中，所述分选包括：

17、(s1)使用裂解液处理原本废弃的标本，获得经裂解液处理的标本；

18、(s2)通过人cd34分选磁珠富集所述经裂解液处理的标本中的cd34+干细胞，分离获得cd34+干细胞。

19、在另一优选例中，所述裂解液处理包括：每1ml废弃的标本加入2ml氯化铵裂解液，4度裂解10min。

20、在另一优选例中，在步骤(b)中，目标cd34+干细胞通过流式细胞术，以cd45dim/+cd34+sslowfslow圈出血液中的目标cd34+干细胞，通过计算目标cd34+细胞数目/cd45+白细胞数目获得目标cd34+干细胞纯度。

21、在另一优选例中，在步骤(b)中，通过胎盘蓝染色细胞，计算目标cd34+干细胞中的活细胞比例。

22、在另一优选例中，在步骤(c)中，所述经扩增的细胞群包括dc前体细胞。

23、在另一优选例中，在步骤(c)中，所述扩增条件包括：在含有扩增培养基的培养体系中，培养所述cd34+干细胞，所述扩增培养基包含选自下组的细胞因子：

24、50ng/ml-150ng/ml，优选60ng/ml-120ng/ml，更优选100ng/ml scf；

25、50ng/ml-150ng/ml，优选60ng/ml-120ng/ml，更优选100ng/ml flt3-l；

26、20ng/ml-100ng/ml，优选30ng/ml-80ng/ml，更优选50ng/ml tpo；

27、5ng/ml-50ng/ml，优选10ng/ml-30ng/ml，更优选20ng/ml il-3。

28、在另一优选例中，在步骤(c)中，所述扩增培养基包含选自选自下组的细胞因子：100ng/ml scf，100ng/ml flt3-l，50ng/ml tpo和20ng/ml il-3。

29、在另一优选例中，在步骤(c)中，所述扩增培养基为无血清培养基(优选stemspan无血清培养基)，包含8-12％fbs(优选10％fbs)。

30、在另一优选例中，在步骤(c)中，所述悬浮培养的时间tc为5-10天，优选为6.5-7.5，更优选为7天。

31、在另一优选例中，在步骤(c)中，细胞数目扩增数为44±12倍。

32、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述分化条件包括：在含有分化培养基的培养体系中，诱导培养所述经扩增的细胞群，所述分化培养基包含选自下组的细胞因子：

33、50ng/ml-150ng/ml，优选60ng/ml-120ng/ml，更优选100ng/ml flt3-l；

34、5ng/ml-50ng/ml，优选10ng/ml-30ng/ml，更优选20ng/ml scf；

35、1ng/ml-5ng/ml，优选2ng/ml-3.5ng/ml，更优选2.5ng/ml il-4；

36、1ng/ml-5ng/ml，优选2ng/ml-3.5ng/ml，更优选2.5ng/ml gm-csf。

37、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述分化培养基包含选自选自下组的细胞因子：100ng/ml flt3-l，20ng/ml scf，2.5ng/ml il-4，2.5ng/ml gm-csf。

38、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述分化培养基为rpmi 1640培养基，包含8-12％fcs(优选10％fcs)。

39、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述分化培养基还包含0.5-2mm丙酮酸钠(优选1mm丙酮酸钠)，1-4mm l-谷氨酰胺(优选2mm l-谷氨酰胺)。

40、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述诱导培养的时间td为12-27天，优选为14-21天，更优选为20±4天。

41、在另一优选例中，步骤(c)和步骤(d)中，悬浮培养的时间tc和诱导培养的时间td(tc+td)优选为27±4天。

42、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述树突状细胞包含未成熟髓样dc细胞，所述未成熟髓样dc为cd141+cd11chigh型细胞。

43、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述cd141+cd11chigh型细胞的数量为1.5-2×107dc，更佳地3.5-7×107dc。

44、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述1×106cd34+干细胞获得5×107有核细胞(cd45+/dim细胞)。

45、在另一优选例中，在步骤(d)中，cd141+cd11chigh型细胞比例(cd141+cd11chigh型细胞的数量/有核细胞数量)为20％-55％，较佳地25％-50％，更佳地30％-40％。

46、在另一优选例中，在步骤(d)中，80％以上的cd141+cd11chigh细胞群的细胞表面表达cd209；90％以上的cd141+cd11chigh细胞群的细胞表面表达hla-dr。

47、在另一优选例中，平均0.5ml体积的废弃的标本获得0.5-1×106cd34+干细胞，经步骤(c)的扩增、步骤(d)的诱导培养获得1.5-2×107的cd141+cd11chigh型细胞，更佳地3.5-7×107的cd141+cd11chigh型细胞。

48、在另一优选例中，在步骤(d)中，分化培养后，还包括进一步分离获得cd209+细胞(cd141+cd11c+dc)。

49、在另一优选例中，所述进一步分离包括采用人cd209(dc-sign)分选试剂盒对细胞进行分选，获得的cd209+细胞的纯度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％。

50、在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括分离获得cd14+单核细胞，对单核细胞进行处理。

51、在另一优选例中，在步骤(b)中，平均0.5ml体积的废弃的标本获得1-5×106cd14+单核细胞。

52、在另一优选例中，所述对单核细胞进行处理，包括：

53、使用含有50ng/ml-150ng/m gm-csf(优选60ng/ml-120ng/ml，更优选100ng/mlgm-csf)和20ng/ml-100ng/ml il-4(优选30ng/ml-80ng/ml，更优选50ng/ml il-4)的培养基(rpmi 1640培养基，10％fcs)培养时间3-7天(优选5天)，获得单核细胞来源dc(modc)。

54、在另一优选例中，平均0.5ml体积的废弃的标本可获得3-7×106数量的modc。

55、在本发明的第二方面，提供了一种树突状细胞群，其通过本发明的第一方面所述的方法获得。

56、在另一优选例中，所述树突状细胞包含cd141+cd11chigh型细胞。

57、在另一优选例中，所述树突状细胞群中，cd141+cd11chigh型细胞比例为20％-55％，较佳地25％-50％，更佳地30％-40％。

58、为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种从干细胞采集物中分离提取cd34+干细胞，所述的干细胞采集物为完成临床检测的干细胞采集物，所述干细胞采集物来源于健康的供干细胞者。

59、为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种从干细胞采集物中分离提取cd34+干细胞的方法，所述的制备方法包括以下步骤：

60、a)每1ml干细胞采集物加入2ml氯化铵裂解液，4度裂解10min；

61、b)采用人cd34分选磁珠富集cd34+干细胞；

62、c)检测cd34+干细胞的纯度和数目；

63、d)冻存cd34+干细胞。

64、为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种从干细胞采集物中分离提取cd34+干细胞的用途。

65、所述的用途为过诱导血液细胞(树突状细胞，嗜碱性粒细胞等)。

66、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。