一种NUTM1融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库与流程

本发明涉及一种nutm1融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库，属于基因测序。

背景技术：

1、nutm1基因位于染色体15q14,编码伴睾丸核蛋白(nut蛋白)，通常在成熟的精原细胞中表达，nut蛋白具有高度保守的酸性结构域、核定位序列和核输出序列。nutm1基因重排是nut中线癌的分子特征，nut中线癌是一种罕见的高度侵袭性恶性肿瘤，中位生存期不到7个月，常表现鳞状细胞癌分化，男女发病率分布相似。目前临床上诊断依赖于临床高度怀疑和nutm1基因重排检测，单克隆c52抗体在临床上用于nut中线癌的诊断，它的灵敏度约在87％。虽然nutm1mrna水平增加，但局灶性的染色可见弱染色或是阴性染色，特别是在nut中线癌中。带有nutm1断点15q14探针的fish是目前临床上检测nutm1重排的金标准，但也有些断点无法通过探针进行检测。nutm1重排的肿瘤通常对于化疗和放疗的响应较差，相较于其他中线癌，发病于胸部的肿瘤预后最差，更有可能发生转移，且与融合伴侣无关。但对于非胸部肿瘤来说，携带非brd4-nutm1的患者预后最好。nut中线癌中，nutm1基因通常与brd4基因发生融合，占比约80％，brd3基因占比约10％，除了常见的brd家族的融合伴侣，越来越多的少见融合伴侣被发现，如znf532、mga、nsd3、mxd1及znf592等基因。除了中线癌外，随着基因检测技术的发展，在肺癌、肉瘤、膀胱癌、肾癌，急性淋巴细胞白血病中也检测到该基因的融合突变。在急性淋巴细胞白血病中，nutm1重排的发生率约为0.7％，以婴幼儿为主，对常规化疗方案较为敏感，且预后通常较好，目前报道的融合伴侣基因为acin1和brd9等。

2、目前nut中线癌还没有指南推荐的最佳治疗方案，关于nutm1基因重排的靶向药物正在积极地研发中，尤其是溴域和末端外域抑制剂(beti)，其为nutm1基因最常见的融合伴侣。brd4-nutm1突变体外细胞系实验发现该融合蛋白可以通过异常的组蛋白乙酰化来驱动肿瘤细胞的增长，并阻断上皮细胞分化。brd4-nut通过嗅结构域与染色体结合，招募p300(一种组蛋白乙酰转移酶)，使局部组蛋白乙酰化区域扩散，从而触发潜在基因的转录，导致关键癌蛋白(如myc、p63、med24等)表达。相应的bet抑制剂(beti)是一种乙酰化组蛋白类似物，通过竞争性抑制brd3/4-nutm1与染色质的结合。体外研究发现，beti抑制剂对于brd4-nut(ex11:ex2)较brd4-nut ex15:ex2和e14:ex2亚型更为敏感，ex15:ex2，e14:ex2表明不同的融合亚型对于药物的响应可能存在差异，beti抑制剂对于brd3-nut也具有一定的抑制作用。此外研究还发现核受体辅激活剂ncoa3基因的异常活性可能与beti的不良反应相关。otx015/mk-8628是第一个针对brd4-nut有临床活性报道的beti，对4例确诊晚期nut癌患者的治疗中，2例获得pr，1位sd，pr的患者os分别能达到18个月和19个月。更多的nut中线癌相关药物，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(hdaci)，hdac/pi3k抑制剂,cdk9抑制剂以及mtor抑制剂均在体外研究中显示出抗肿瘤活性。综合来看精确的检测并区分nutm1不同的融合亚型，不仅可以作为患者预后预测的依据，同时能够不断完善nutm1重排相关肿瘤的分子致病机制，为相应靶向药物开发和实验提供更多的基础，具有重要的临床意义。同时对于nut中线癌更多分子特征的挖掘研究也有助于药物耐药机制的探究，和更多靶向药物的开发利用，为这类恶性程度极高的肿瘤患者，提供更长以及更高质量的生存获益。

3、目前临床上常用的融合检测方法主要有三种，1)免疫组化检测ihc，该方法直接检测蛋白表达，不受融合伴侣的限制，但也无法明确具体融合亚型，且抗体非特异性染色和主观判断会影响检测的准确性，同时该方法仅能利用组织样本，其他样本类型无法进行操作；2)原位荧光杂交(fish)，通过设计荧光探针，检测融合突变的发生，是目前临床上较常用的融合检测方法，但该方法也没法明确具体融合伴侣和相对应的融合亚型，和ihc一样只能利用组织样本进行检测，其他体液样本无法利用该技术进行分析；3)rt-pcr，该方法可操作性强，灵敏度高，但只能检测已知融合和融合亚型，无法检测未知的融合。

技术实现思路

1、本发明需要解决的技术问题是传统nutm1基因重排检测技术中存在的一些问题，如无法明确伴侣基因，无法明确具体融合亚型以及检测样本类型受限等问题。特别是本发明有助于一些罕见融合的检出如(smurf1-nutm1以及一些igr融合)，同时能够提供更多患者的基因图谱特征，有助于患者后续治疗指导。

2、一种nutm1融合基因的检测方法，包括如下步骤：

3、1)获得受试者的dna样本库；

4、2)获得所述的探针库；

5、3)使探针库与所述dna样本库进行杂交；

6、4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的fgfr融合基因dna片段；

7、5)通过高通量测序的方法对fgfr融合基因dna片段进行检测；

8、所述的探针库中包括有核苷酸序列如seq id no.1～118所示的全部探针。

9、所述的检测方法用于非治疗和诊断目的。

10、所述的步骤1)中，dna样本库通过如下步骤获得：

11、1-1)提取全基因组dna，然后将其片段化；或者1-2)提取mrna，将其片段化，然后以该经片段化的mrna为模板合成双链cdna。

12、所述的步骤1)中，从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组dna或mrna。

13、所述的步骤3)中，杂交过程温度范围60-70℃，时间15-30h。

14、所述的步骤4)中，经杂交富集的fgfr融合基因dna片段还需要进行pcr扩增处理，反应体系是：dna文库25ul、taqdnapolymerasebuffer5ul、dnapolymerase1ul、正向/反向引物各1ul，蒸馏水补足至50ul。

15、反应条件是96℃预变性35秒，96℃变性20秒，65℃退火40秒，72℃延伸25秒，循环6次；72℃延伸5分钟。

16、探针库在用于制备检测fgfr融合基因的试剂盒中的应用，其所述的探针库中包括有核苷酸序列如seq id no.1～118所示的全部探针。

17、有益效果

18、本发明基于的ngs技术不仅能够检测出目前报道的各种nutm1基因融合形式，还能够检出未报道的融合类型，明确具体融合亚型，同时还能够检测出其他基因变异情况为患者后续耐药或是用药指导提供参考依据。此外ngs检测除了可以针对组织样本外，同时可以利用体液样本进行融合检测，其检测灵敏度也远高于目前传统检测技术。

技术特征：

1.一种nutm1融合基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的nutm1融合基因的检测方法，其特征在于，所述的检测方法用于非治疗和诊断目的。

3.根据权利要求1所述的nutm1融合基因的检测方法，其特征在于，所述的步骤1）中，dna样本库通过如下步骤获得：

4.根据权利要求1所述的nutm1融合基因的检测方法，其特征在于，所述的步骤1）中，从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组dna或mrna。

5.根据权利要求1所述的nutm1融合基因的检测方法，其特征在于，所述的步骤3）中，杂交过程温度范围60-70℃，时间15-30h。

6.根据权利要求1所述的nutm1融合基因的检测方法，其特征在于，所述的步骤4）中，经杂交富集的fgfr融合基因dna片段还需要进行pcr扩增处理，反应体系是：dna文库25ul、taqdna polymerase buffer 5ul、dna polymerase1ul、正向/反向引物各1ul，蒸馏水补足至50ul。

7.根据权利要求1所述的nutm1融合基因的检测方法，其特征在于，反应条件是96℃预变性35秒，96℃变性20秒，65℃退火40秒，72℃延伸25秒，循环6次；72℃延伸5分钟。

技术总结
本发明提供NUTM1基因融合探针、检测方法和试剂盒，本方法采用液相富集法对样本中的NUTM1存在融合基因的片段进行富集，通过建库、测序后，能够有效地对NUTM1融合基因进行检测，具有灵敏度高、检测覆盖面大的优点。

技术研发人员：邵阳,汪笑男,吴雪,逄娇慧,吴晓英,那成龙
受保护的技术使用者：南京世和基因生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15