阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物与流程

本发明涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物。

背景技术：

1、阿糖类核苷是将脱氧核糖替换为阿拉伯糖的核苷，在被掺入dna后可阻止dna的复制进而影响细胞的分裂和增殖，因而可作为抗病毒和抗肿瘤类药物用于相关疾病的治疗，如疱疹，肿瘤、艾滋病、乙肝等。目前，阿糖核苷类主要以化学法(cn1042939c，cn107556356a,cn1128270a,cn103467468a，cn107892707a)和生物法合成(cn106929553a，jph10286097a，cn105237602a)。其中，化学合成工艺过程复杂，成本较高，且反应条件苛刻，需使用重金属，有机溶剂等，会对人员健康造成危害并对引起环境污染等问题。而生物法是利用微生物表达的酶作为催化剂，在温和条件下即可将底物转化为相关产品，操作步骤简单，且反应条件则相对温和，不需要使用重金属和有机试剂等对人体和环境有害的物质。

2、专利cn106929553a公开了一种两步法合成阿糖腺苷的方法，可通过使用尿苷磷酸化酶将阿糖尿苷转化为阿糖-1-磷酸，经分离后再利用腺嘌呤核苷磷酸化酶将其和腺嘌呤合成阿糖腺苷，其转化率达90％以上。魏晓琨等人发表了一种两步法合成阿糖鸟苷的方法，首先利用可表达嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)将阿糖尿苷和2,6-二氨基嘌呤合成2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷，然后利用来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的腺苷脱氨酶将2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷脱去氨基进一步生成阿糖鸟苷，当底物浓度低于10mm时，2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷转化率为80％；但底物浓度高于10mm时，2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷的转化率则显著降低至50％以下。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物，以解决现有技术中生物合成两步法制备阿糖类核苷操作复杂的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法，该方法包括：底物、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶，共同混合后进行生物合成，一锅法直接制备获得阿糖类核苷；其中，尿嘧啶核苷磷酸化酶包括up、或与up具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，up为seq idno：1所示的蛋白质；嘧啶核苷磷酸化酶包括pynp、或与pynp具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，pynp为seq id no：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括pnp、或与pnp具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，pnp为seq id no：3所示的蛋白质；底物包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐。

3、进一步地，方法包括：阿糖尿苷和底物磷酸盐在尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶的催化下，生成阿拉伯糖-1-磷酸和游离碱基；阿拉伯糖-1-磷酸在嘌呤核苷磷酸化酶的催化下，底物碱基取代磷酸基团，获得阿糖类核苷。

4、进一步地，底物碱基为式i所示的碱基，r1选自-nh2、＝o、-ome或-cl，r2选自-h、-nh2、-cl或-f；优选地，底物碱基包括2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤；

5、

6、进一步地，嘌呤核苷磷酸化酶、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。

7、进一步地，一锅法生物合成的催化时间为4～20h；优选地，一锅法生物合成的催化温度为50～80℃，更优选为60～70℃；优选地，阿糖尿苷的浓度为2～320mm，底物碱基的浓度为1～200mm，底物磷酸盐的浓度为1～100mm。

8、进一步地，阿糖类核苷包括2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、奈拉滨、2-氯腺嘌呤阿拉伯糖苷或氟达拉滨；底物磷酸盐包括磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种，或磷酸缓冲液，或磷酸盐缓冲液。

9、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种组合物，该组合物包括尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶；尿嘧啶核苷磷酸化酶包括up、或与up具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，up为seq id no：1所示的蛋白质；嘧啶核苷磷酸化酶包括pynp、或与pynp具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，pynp为seq id no：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括pnp、或与pnp具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，pnp为seq id no：3所示的蛋白质；

10、进一步地，嘌呤核苷磷酸化酶、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。

11、进一步地，组合物还包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐；优选地，底物磷酸盐包括磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或多种，或磷酸缓冲液，或磷酸盐缓冲液。

12、进一步地，底物碱基为式i所示的碱基，r1选自-nh2、＝o、-ome或-cl，r2选自-h、-nh2、-cl或-f；优选地，底物碱基包括2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氯腺嘌呤或2-氟腺嘌呤；优选地，阿糖尿苷的浓度为2～320mm，底物碱基的浓度为1～200mm，底物磷酸盐的浓度为1～100mm；

13、

14、应用本发明的技术方案，利用嘌呤核苷磷酸化酶、以及嘧啶核苷磷酸化酶或尿嘧啶核苷磷酸化酶，能够以阿糖尿苷和底物碱基为底物，一锅法生物合成制备目标产物阿糖类核苷，无需进行中途补料或中间产物纯化再投料等操作，相较于两步法制备，操作更简单，利用工业化放大生产。

技术特征：

1.一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物碱基为式i所示的碱基，r1选自-nh2、＝o、-ome或-cl，r2选自-h、-nh2、-cl或-f；

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嘌呤核苷磷酸化酶、所述尿嘧啶核苷磷酸化酶或所述嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一锅法生物合成的催化时间为4～20h；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阿糖类核苷包括2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、奈拉滨、2-氯腺嘌呤阿拉伯糖苷或氟达拉滨；

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶；

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述嘌呤核苷磷酸化酶、所述尿嘧啶核苷磷酸化酶或所述嘧啶核苷磷酸化酶中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。

9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括阿糖尿苷、底物碱基和底物磷酸盐。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述底物碱基为式i所示的碱基，r1选自-nh2、＝o、-ome或-cl，r2选自-h、-nh2、-cl或-f；

技术总结
本发明提供了一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物。其中，阿糖类核苷一锅法生物合成的方法包括：底物、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶，共同混合后进行生物合成，一锅法直接制备获得阿糖类核苷。尿嘧啶核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：1所示的UP；嘧啶核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：2所示的PyNP；嘌呤核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：3所示的PNP；底物包括阿糖尿苷和底物碱基。能够解决现有技术中生物合成两步法制备阿糖类核苷操作复杂的问题，适用于酶催化领域。

技术研发人员：洪浩,詹姆斯·盖吉,肖毅,张娜,焦学成,李明记,李瑞,丁是卯
受保护的技术使用者：凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12