一种土传病原菌的高通量检测引物及其检测方法与流程

本发明属于生物，涉及一种土传病原菌的高通量检测引物及其检测方法。

背景技术：

1、土传病原菌是一类危害农作物产量和品质的微生物，其特点在于种类繁多，在土壤中可长期定殖，通过侵染作物造成损失。而在分子水平下检测土传病原菌，可以及时监测土壤微生物健康水平，以达到快速鉴定多种土传植物病害和预防土传植物病害的目的。

2、目前很少有涉及土传病原菌微生物的基因芯片开发设计，一方面源于现有鉴定土传病害多基于作物形态表征，另一方面在于研究土传病害的pcr反应引物设计不同，反应条件不一，难以简单整合，增加了芯片设计的难度。现有分子学检测土传病原菌的pcr方法大都是通过单一特定引物扩增、测序后比对数据库，针对单一特定引物扩增这一步骤在分析处理多种土传病害上耗时长。基因芯片技术是将特定的核苷酸序列固定在基片上，利用核苷酸引物结合的方式进行的分子水平检测，其具有在特定程序下一次检验多个基因序列的特性。随着越来越多的土传病原菌微生物需要研究，亟需一种可以同时检测多种微生物功能基因的方法以提升效率。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种可快速、高效检测土壤中土传病原菌的高通量检测分子标记物。

2、本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种土传病原菌的高通量检测分子标记物，所述分子标记物包括seq id no:1-86所示的上下游引物序列。

3、在上述的一种土传病原菌的高通量检测分子标记物中，土传病原菌包括黑白轮枝菌、大丽轮枝菌、变黑轮枝菌、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、棒孢叶斑病菌、尖孢枝孢菌、冬青丽赤壳菌、层出镰刀菌、木贼镰孢菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌、青枯菌、烟草疫霉菌、茄链格孢、互隔交链孢菌、蔓枯病病菌、丁香假单胞杆菌、黄瓜织球壳菌、晚疫病菌、多主棒孢、黄瓜炭疽病菌、丁香假单胞杆菌流泪致病变种、丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病型、黄瓜菌核病菌、黄瓜细菌性萎蔫病菌、燕麦嗜酸菌西瓜亚种、胶孢炭疽菌、番茄白粉菌、番茄溃疡病菌、疮痂病菌、番茄匍柄霉菌、茄匍柄霉菌、齐整小核菌、腐皮镰孢菌、瓜果腐霉菌、古巴假霜霉菌、枝状枝孢霉、瓜疮痂枝孢霉菌、瓜类蔓枯病菌、番茄煤污假尾孢中的至少一种。

4、一种土传病原菌的高通量检测芯片，所述芯片包括上述的分子标记物。

5、一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法，其特征在于，使用了上述分子标记物或上述的检测芯片。

6、在上述的一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法中，所述方法包括如下步骤：从土壤中提取dna，然后对dna和引物进行分配，再进行高通量定量pcr扩增，最后进行结果与数据分析。

7、在上述的一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法中，所述高通量定量pcr的反应体系包括反应体系1和反应体系2；其中反应体系1包括600-700μl lightcycler480dna sybr greeni mix和350-450μl高纯水；反应体系2包括55-650μllightcycler480dna sybr green i mix、100-150μl牛血清白蛋白水溶液和200-300μl高纯水。

8、在上述的一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法中，高通量定量pcr扩增程序为：90-100℃预变性3-8min，40个循环的变性(90-100℃×30s)、退火(55-60℃×30s)和延伸(70-75℃×1min)，最后从70-75℃开始升温至95-100℃。

9、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明实现了多种土传病原的高通量同步化检测；通过设计、筛选并优化了引物的组成和布设，使不同病原菌基因得以在同一扩增条件下进行检测，提高检测效率；本发明可以检测低至0.001％的目的基因，检测精度高；而且整合了常见及危害严重的土传病原菌引物序列，兼顾pcr检测优点，可以快速准确鉴定识别多种土传病原菌。

技术特征：

1.一种土传病原菌的高通量检测分子标记物，其特征在于，所述分子标记物包括seqid no:1-86所示的上下游引物序列。

2.根据权利要求1所述的一种土传病原菌的高通量检测分子标记物，其特征在于，土传病原菌微生物包括黑白轮枝菌、大丽轮枝菌、变黑轮枝菌、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、棒孢叶斑病菌、尖孢枝孢菌、冬青丽赤壳菌、层出镰刀菌、木贼镰孢菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌、青枯菌、烟草疫霉菌、茄链格孢、互隔交链孢菌、蔓枯病病菌、丁香假单胞杆菌、黄瓜织球壳菌、晚疫病菌、多主棒孢、黄瓜炭疽病菌、丁香假单胞杆菌流泪致病变种、丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病型、黄瓜菌核病菌、黄瓜细菌性萎蔫病菌、燕麦嗜酸菌西瓜亚种、胶孢炭疽菌、番茄白粉菌、番茄溃疡病菌、疮痂病菌、番茄匍柄霉菌、茄匍柄霉菌、齐整小核菌、腐皮镰孢菌、瓜果腐霉菌、古巴假霜霉菌、枝状枝孢霉、瓜疮痂枝孢霉菌、瓜类蔓枯病菌、番茄煤污假尾孢中的至少一种。

3.一种土传病原菌的高通量检测芯片，其特征在于，所述芯片包括权利要求1所述的分子标记物。

4.一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法，其特征在于，使用了权利要求1所述分子标记物或权利要求3所述的检测芯片。

5.根据权利要求4所述的一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：从连作障碍土壤中提取dna，然后对dna和引物进行分配，再进行高通量定量pcr扩增，最后进行结果与数据分析。

6.根据权利要求5所述的一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法，其特征在于，所述高通量定量pcr的反应体系包括反应体系1和反应体系2；其中反应体系1包括600-700μl lightcycler 480dna sybr greeni mix和350-450μl高纯水；反应体系2包括55-650μllightcycler 480dna sybr green i mix、100-150μl牛血清白蛋白水溶液和200-300μl高纯水。

7.根据权利要求5所述的一种土传病原菌的高通量检测芯片的检测方法，其特征在于，高通量定量pcr扩增程序为：90-100℃预变性3-8min，40个循环的变性(90-100℃×30s)、退火(55-60℃×30s)和延伸(70-75℃×1min)，最后从70-75℃开始升温至95-100℃。

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及一种土传病原菌的高通量检测引物及其检测方法。本发明实现了多种土传病原的高通量同步化检测；通过设计、筛选并优化了引物的组成和布设，使不同病原菌基因得以在同一扩增条件下进行检测，提高检测效率；本发明可以检测低至0.001％的目的基因，检测精度高；而且整合了常见及危害严重的土传病原菌引物序列，兼顾PCR检测优点，可以快速准确鉴定识别多种土传病原菌。

技术研发人员：姚槐应,苏浩,李雅颖,张锐澎,吴思炫
受保护的技术使用者：宁波（北仑）中科海西产业技术创新中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13