ccdc66突变体果蝇模型及其构建方法和应用

本发明属于生物学，具体涉及ccdc66突变体果蝇模型及其构建方法和应用。

背景技术：

1、黑腹果蝇是一种常用的无脊椎动物模式，具有生命周期短、易于大规模饲养、花费低、遗传背景清晰、遗传操作简单、与哺乳动物基因保守等优势，被越来越广泛地用于人类疾病致病诊疗、疾病机制研究和药物靶点的筛选。

2、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,rp)是一种因视网膜退化和视力缺失而导致的人类视网膜病变(berger et al.,2010)。ccdc66是人视网膜色素变性的一个致病因子，通过影响中心体微卫星结构的组装和纤毛发生，参与光受体的发育和维持、组装和功能发挥等(dekomien et al.,2010；gupta et al.,2015；sharp et al.,2011)。不同物种参与眼建成和视觉传导的关键调控因子、调控网络和传输机制高度保守。ccdc66功能缺陷能引发视网膜退化，然而，ccdc66基因突变引发rp的作用机制未被解析。ccdc66为不明原因的视网膜退化提供一个可能的靶点(gerding et al.,2011)。ccdc66动物模型的建立将为视网膜疾病的病理生理特征的揭示和rp的治疗等提供重要的启示(koenekoop et al.,2007；torres and harris,2007)。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供ccdc66突变体果蝇模型及其构建方法和应用。

2、本发明通过同源搜索，定义出人视网膜色素变性疾病基因ccdc66在果蝇中的同源序列，之后借助crispr-cas9、显微注射技术和果蝇杂交技术获得ccdc66突变体果蝇。

3、本发明的技术方案如下：

4、本发明一方面提供一种用于敲除果蝇ccdc66基因的grna组合物，所述grna组合物包括如seq id no.4序列所示的grna1和如seq id no.5序列所示的grna2。

5、本发明再一方面提供一种ccdc66突变体果蝇模型的构建方法，包括如下步骤：

6、(1)构建所述grna1的表达载体和grna2的表达载体；

7、(2)将所述grna1的表达载体和grna2的表达载体注射到nos-cas9(ii)的果蝇胚胎中，胚胎培育成虫后，每只g0代果蝇分别单独与平衡子果蝇进行杂交，待获得足够的g1代幼虫，每杂交管挑选5只g1代幼虫，提取它们的dna，确定包含了敲除突变体的杂交管，随后该管的g1成虫分别单独与平衡子果蝇杂交，待获得足够的g2幼虫或蛹，分别提取每只g1代成虫的dna，借助pcr扩增和测序确定ccdc66成功敲除的突变体果蝇和缺失基因序列，挑选携带mkrs平衡子的突变体，与平衡子果蝇进行回交，获得稳定遗传的ccdc66突变体果蝇品系，即为ccdc66突变体果蝇模型。

8、进一步地，步骤(1)中所述grna1的表达载体和grna2的表达载体分别为peasy-blunt-grna1质粒和peasy-blunt-grna2质粒；

9、所述peasy-blunt-grna1质粒或peasy-blunt-grna2质粒的构建方法，包括：

10、将果蝇u6.3启动子序列克隆进peasy-blunt质粒中，获得peasy-blunt改造质粒，将peasy-blunt改造质粒转化入大肠杆菌，获得初始模板peasy-blunt质粒；

11、以初始模板peasy-blunt质粒为模板，使用包含所述grna序列和grna插入位点前、后质粒序列的引物进行pcr反应，获得包含目的grna序列的pcr扩增产物；

12、用dpni酶消化pcr扩增产物，反应结束后，灭活dpni酶，将酶切产物转入大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养后，对转化子进行菌落pcr、测序，获得含有目的grna的阳性克隆子，即构建得到peasy-blunt-grna1质粒或peasy-blunt-grna2质粒。

13、进一步地，所述包含所述grna序列和grna插入位点前、后质粒序列的引物序列如下：

14、ccdc66 grna1-f：

15、5’-atgtatcgaagaaccaggaggttttagagctagaaatagc-3’seq id no.6；

16、ccdc66 grna1-r：

17、5’-ctcctggttcttcgatacatcgacgttaaattgaaaatagg-3’seq id no.7；

18、ccdc66 grna2-f：

19、5’-agtgccagtgtcctggatgggttttagagctagaaatagc-3’seq id no.8；

20、ccdc66 grna2-r：

21、5’-ccatccaggacactggcactcgacgttaaattgaaaatagg-3’seq id no.9。

22、进一步地，步骤(2)中所述grna1的表达载体和grna2的表达载体的注射用量之比为1:1。

23、进一步地，所述平衡子果蝇为ywr13s平衡子果蝇。

24、本发明再一方面提供所述构建方法获得的ccdc66突变体果蝇模型。

25、本发明再一方面提供所述ccdc66突变体果蝇模型作为人视网膜色素变性疾病的动物模型的应用。

26、本发明再一方面提供所述ccdc66突变体果蝇模型在人视网膜色素变性疾病治疗药物筛选中的应用。

27、本发明再一方面提供所述ccdc66突变体果蝇模型在人视网膜色素变性疾病药物靶点筛选中的应用。

28、本发明的有益效果为：

29、本发明利用同源序列搜索，鉴定到人ccdc66在果蝇中的同源基因，之后借助crispr-cas9、显微注射技术和果蝇杂交技术制备了ccdc66突变体果蝇模型。相较于脊椎动物，果蝇具有个体小、易于大规模培养、成本低、世代周期短、遗传操作简单等优势；相较于其它无脊椎动物，果蝇具有遗传背景清晰，蛋白、细胞器和信号传导通路等与人更为保守等优势，因此本发明构建的ccdc66突变体果蝇模型可为人视网膜色素变性病的诊断、机制解析和药物靶点的筛选等提供材料。此外，本发明制备ccdc66突变体果蝇的思路和方案，可为其它疾病的果蝇模型建立提供借鉴。

技术特征：

1.一种用于敲除果蝇ccdc66基因的grna组合物，其特征在于，所述grna组合物包括如seq id no.4序列所示的grna1和如seq id no.5序列所示的grna2。

2.一种ccdc66突变体果蝇模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述grna1的表达载体和grna2的表达载体分别为peasy-blunt-grna1质粒和peasy-blunt-grna2质粒；

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述包含权利要求1所述grna序列和grna插入位点前、后质粒序列的引物序列如下：

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述grna1的表达载体和grna2的表达载体的注射用量之比为1:1。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述平衡子果蝇为ywr13s平衡子果蝇。

7.权利要求2-6任一项所述构建方法获得的ccdc66突变体果蝇模型。

8.权利要求7所述ccdc66突变体果蝇模型作为人视网膜色素变性疾病的动物模型的应用。

9.权利要求7所述ccdc66突变体果蝇模型在人视网膜色素变性疾病治疗药物筛选中的应用。

10.权利要求7所述ccdc66突变体果蝇模型在人视网膜色素变性疾病药物靶点筛选中的应用。

技术总结
本发明公开了ccdc66突变体果蝇模型及其构建方法和应用，具体公开一种用于敲除果蝇Ccdc66基因的gRNA组合物，其包括如SEQ ID NO.4序列所示的gRNA1和如SEQ ID NO.5序列所示的gRNA2。进一步公开ccdc66突变体果蝇模型的构建方法，通过构建gRNA1的表达载体和gRNA2的表达载体，之后借助显微注射技术和果蝇杂交技术获得ccdc66突变体果蝇模型。本发明ccdc66突变体果蝇模型具有个体小，易于大规模培养，成本低，世代周期短，遗传操作简单，遗传背景清晰，蛋白、细胞器和信号传导通路与人更为保守等优势，可为人视网膜色素变性病的诊断、机制解析和药物靶点的筛选提供材料。

技术研发人员：侯亚男,卫青
受保护的技术使用者：中国科学院深圳先进技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29