一种催化效率提高的丙酮酸脱羧酶突变体及其应用

本发明涉及一种催化效率提高的丙酮酸脱羧酶突变体及其应用，属于酶工程。

背景技术：

1、4-羟基苯乙醛(4-hpaa)是一种天然芳香醛，可用作生产工业上重要的医药中间体(如苄基异喹啉生物碱和酪醇)的前体，具有非常可观的经济价值。

2、目前，4-hpaa的工业化生产主要依靠化学转化技术，例如在强酸存在下水解酪氨酸或辛弗林。然而，化学过程需要苛刻的反应条件，过程复杂性高且对环境不友好。基于这些考虑，生物催化是一种有吸引力的替代方案。酶转化法具备高产量、高转化率以及较短的转化周期等优点而更具备工业应用价值。

3、生物催化生产4-hpaa涉及到的酶-丙酮酸脱羧酶(pdc，pyruvate decarboxylase，ec 4.1.1.1)，是一种胞内酶，是焦磷酸硫胺素(thiamine diphosphate，thdp)依赖性的非氧化酶,是由辅酶thdp、mg2+和蛋白质构成的全酶，在辅助因子焦磷酸硫胺素和mg2+参与下作用于底物4-羟基苯丙酮酸(4-hppa)而产生4-hpaa和co2。它广泛存在于酵母菌、霉菌、细菌和植物等多种生物体中，不同来源的丙酮酸脱羧酶的结构、相对分子质量、酶学性质等均不尽相同，本发明中提到的pdc来源于热带假丝酵母(candida tropicalis)，即ctpdc。由于ctpdc催化4-hppa生产4-hpaa的脱羧转化率不高，对其酶学性质以及结构进行了研究，数据表明酶活低是限制ctpdc脱羧效率的主要原因，因此也成为本实验室已有的多酶级联合成酪醇路径中的限速酶。

4、近几十年来，蛋白质工程已经成为在分子水平改善酶的性质的有效策略，如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性的最有效的方法。因此，通过蛋白质工程设计ctpdc，可能解决其催化活性低的问题。蛋白质工程改造主要可以分四类：传统的定向进化(即非理性设计)、半理性设计、理性设计(基于结构与计算机技术)和多种策略的组合应用。目前，关于利用蛋白质工程改造pdc的研究并未有卓越的进展，大多数研究中的突变体只是验证了关键残基的作用，或者研究酶的催化混杂性，并未在酶的脱羧活性提升上有显著效果，所以蛋白质工程改造pdc的工作任重道远。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种可以制备4-hpaa的重组丙酮酸脱羧酶ctpdc突变体，所述丙酮酸脱羧酶氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seq idno.2所示。本发明提供的ctpdc突变体酶活较野生型有所提升，利用此丙酮酸脱羧酶突变体所构建的菌株在4-hpaa制备过程中提升了脱羧转化率，并在一定程度上解除了生产酪醇的级联步骤中的限速瓶颈。

2、本发明的第一个目的是提供一种催化效率提高的丙酮酸脱羧酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no.1所示的丙酮酸脱羧酶(ctpdc)亲本的395位苯丙氨酸、415位的甘氨酸、477位酪氨酸中的一种进行突变或多种进行组合突变。

3、进一步地，所述突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第395位的苯丙氨酸突变为丝氨酸。

4、进一步地，所述突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第415位的甘氨酸突变为丝氨酸。

5、进一步地，所述突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第395位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，同时将第415位氨基酸突变为丝氨酸。

6、进一步地，所述突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第415位的甘氨酸突变为丝氨酸，同时将第477位氨基酸突变为苯丙氨酸。

7、进一步地，所述的突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第395位的苯丙氨酸突变为丝氨酸、将第415位氨基酸突变为丝氨酸，同时将第477位氨基酸突变为苯丙氨酸。

8、本发明的第二个目的是提供一种编码所述的突变体的基因。

9、本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。

10、本发明的第四个目的是提供一种表达所述突变体的菌株。

11、进一步地，所述的菌株是以大肠杆菌为宿主。

12、本发明的第五个目的是提供所述的菌株在制备4-羟基苯乙醛中的应用，所述的应用是以4-羟基苯丙酮酸为底物，以所述菌株为催化剂，在ph 6.0～6.5、25～30℃条件下反应6～12h制备4-羟基苯乙醛。

13、进一步地，所述的菌株在反应体系中的添加量为终浓度15～25g/l。

14、进一步地，所述的4-羟基苯丙酮酸在反应体系中的终浓度为5～10g/l。

15、本发明的有益效果是：

16、本发明构建了一种来源于热带假丝酵母的丙酮酸脱羧酶突变体，用于催化生产4-羟基苯乙醛。本发明突变体的催化半衰期(5.7h)和ttn(24600)较对照分别提高了2.85倍和2.07倍，且突变体表现出较高的脱羧活性。本发明得到的突变体在以4-羟基苯丙酮酸为底物时，在25℃、ph 6.5的条件下反应12h，4-羟基苯乙醛的产量可达5.08g/l，底物摩尔转化率达到67.28％。采用本发明的方法，提高了单位催化剂的生产能力和催化剂的反应效率，加快了酶转化法生产4-羟基苯乙醛的工业化进程。

技术特征：

1.一种催化效率提高的丙酮酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述的突变体是在氨基酸序列如seq id no.1所示的丙酮酸脱羧酶亲本的395位苯丙氨酸、415位的甘氨酸、477位酪氨酸中的一种进行突变或多种进行组合突变。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第395位的苯丙氨酸突变为丝氨酸。

3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第415位的甘氨酸突变为丝氨酸。

4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第395位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，同时将第415位氨基酸突变为丝氨酸。

5.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第415位的甘氨酸突变为丝氨酸，同时将第477位氨基酸突变为苯丙氨酸。

6.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体为将丙酮酸脱羧酶亲本的第395位的苯丙氨酸突变为丝氨酸、将第415位氨基酸突变为丝氨酸，同时将第477位氨基酸突变为苯丙氨酸。

7.一种编码权利要求1～6任一项所述的突变体的基因。

8.一种携带权利要求7所述基因的表达载体。

9.一种表达权利要求1～6任一项所述突变体的菌株。

10.权利要求9所述的菌株在制备4-羟基苯乙醛中的应用，其特征在于，所述的应用是以4-羟基苯丙酮酸为底物，以所述菌株为催化剂，在ph 6.0～6.5、25～30℃条件下反应6～12h制备4-羟基苯乙醛。

技术总结
本发明公开了一种催化效率提高的丙酮酸脱羧酶突变体及其应用，本发明构建了一种来源于热带假丝酵母的丙酮酸脱羧酶突变体，用于催化生产4‑羟基苯乙醛。本发明突变体的催化半衰期(5.7h)和TTN(24600)较对照分别提高了2.85倍和2.07倍，且突变体表现出较高的脱羧活性。本发明得到的突变体在以4‑羟基苯丙酮酸为底物时，在25℃、pH 6.5的条件下反应12h，4‑羟基苯乙醛的产量可达5.08g/L，底物摩尔转化率达到67.28％。采用本发明的方法，提高了单位催化剂的生产能力和催化剂的反应效率，加快了酶转化法生产4‑羟基苯乙醛的工业化进程。

技术研发人员：吴静,徐欢欢,刘立明,宋伟,周怡雯,陈修来,刘佳,高聪
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11