一种噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法及应用与流程

本发明涉及基因工程，具体涉及一种噬菌体与宿主共生的进化淀粉酶的方法及应用。

背景技术：

1、定向进化旨在通过基因多样化和突变库筛选的迭代循环，加速实现在胞内或胞外进行的自然进化过程。近年来，因其强大的功能而被广泛应用于生物工程当中。连续定向进化旨在无人为干预的情况下完成基因突变、蛋白表达、表型选择与筛选的迭代实验。连续定向进化通过缩短每轮的进化时间来增加迭代次数，从而提高获得目标性状突变体的概率。

2、由d.liu课题组开发的噬菌体辅助的连续进化系统(phage-assisted continuousevolution，pace)是近年来最经典的案例。pace将目标蛋白编码序列引入筛选噬菌体dna载体中(selectionphage，sp)，并通过敲除piii蛋白编码区而阻断噬菌体侵染力，同时将含有piii的辅助质粒(accessory plasmid，ap)和提高大肠杆菌基因突变率的突变质粒(mutator plasmid，mp)引入大肠杆菌内。通过设计特定的基因回路，将piii的表达与目标蛋白的活性相偶联，再通过类似“潟湖”的液路控制系统使得含有目标活性突变体的噬菌体迭代富集，从而实现进化与筛选自动循环。由于从噬菌体侵染到再组装的周期较为短暂，因此pace系统可以在24小时内完成30轮以上的蛋白质进化，达到其他定向进化手段难以企及的迭代次数。自2011年以来，d.liu课题组利用pace已成功完成了对多种蛋白的改造，如基于蛋白与dna序列互作原理，成功对t7聚合酶、talen、spcas9、胞嘧啶碱基编辑(cbes)、腺嘌呤碱基编辑器(abes)进行工程改造，改变了其识别序列的范围或提高了其识别特异性。然而其并未涉及淀粉酶的进化。

3、中国发明专利cn114807202a公开了一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化系统和方法，涉及一种在软琼脂上借助噬菌体进化膜蛋白lacy对纤维寡糖转运效率的方法，该方法是借助阻遏蛋白celr将lacy转运纤维寡糖的活性与噬菌体的增值偶联，但是进化其他的酶或蛋白不一定能找到类似celr的功能蛋白。并且piii蛋白如果有本底表达，会赋予宿主噬菌体侵染抗性，对进化系统有较大负面影响，会降低进化效率甚至破坏整个进化体系。

技术实现思路

1、有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法及应用，进化淀粉酶的酶活性。

2、为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法：以野生型sp-amyc作为噬菌体，将av1质粒、诱变质粒aemp共转化携带f因子的大肠杆菌得到宿主菌，在以淀粉为唯一碳源的m9培养基中生长；所述av1质粒辅助表达gvi蛋白，核酸序列如seq idno.2所示；所述诱变质粒aemp核酸序列如seq id no.3所示；所述野生型sp-amyc核酸序列如seq id no.4所示。

4、sp-amyc携带的淀粉酶基因amyc表达淀粉酶水解，m9淀粉软琼脂平板上的淀粉为宿主提供可利用的碳源，以此循环共生，在突变质粒aemp的辅助下，正向突变使共生体系维持在共生斑前沿。

5、进一步的，所述av1质粒的gvi蛋白可由任何启动子启动表达。

6、优选的，所述av1质粒的gvi蛋白由噬菌体休克启动子ppsp启动。

7、进一步的，所述诱变质粒aemp由ppsp启动子启动。

8、进一步的，所述携带f因子的大肠杆菌为fm15，基因型为f’proa+b+laci qδ(lacz)m15 zzf::tn10(tetr)/λ–ilvg–rfb-50 rph-1 attb::kan rδ(lacz)m15。

9、进一步的，m9培养基配方中可溶性淀粉的浓度随着进化逐步降低以增加筛选压力。

10、进一步的，第一次进化时，m9培养基配方包含0.4％可溶性淀粉、0.1％ sl-4、0.2％agar。

11、第二方面，本发明提供采用上述噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法进化得到的淀粉酶突变体。

12、第三方面，本发明提供采用上述噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法进化得到的淀粉酶突变体的表达载体，包括所述淀粉酶突变体的突变位点或突变位点的组合。

13、第四方面，本发明提供上述噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法进化得到的淀粉酶突变体在生物学上的应用。

14、本发明的有益效果为：

15、本发明公开的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法中，当携带拟进化淀粉酶基因amyc(替换噬菌体上gvi位置)的噬菌体sp-amyc侵染大肠杆菌后，噬菌体上的淀粉酶基因表达淀粉酶，淀粉酶水解软琼脂上的唯一碳源淀粉产生小分子麦芽寡糖可以为大肠杆菌提供生长所需的能量，而新产生的子代大肠杆菌又可以继续被子代噬菌体继续侵染，以此循环共生。在诱变质粒aemp提供突变的情况下，携带淀粉酶活性较高突变体的噬菌体，其所侵染的大肠杆菌便能获得更多的能量，生长较快，在软琼脂板上进化区域的最前沿。相对传统进化方法，本发明更加高效便捷，不用建库及大量的人工筛选，成本低廉，人为干预极少。

技术特征：

1.一种噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法，其特征在于，以野生型sp-amyc作为噬菌体，将av1质粒、诱变质粒aemp共转化携带f因子的大肠杆菌得到宿主菌，在以淀粉为唯一碳源的m9培养基中生长；所述av1质粒辅助表达gvi蛋白，核酸序列如seq id no.2所示；所述诱变质粒aemp核酸序列如seq id no.3所示；所述野生型sp-amyc核酸序列如seq id no.4所示。

2.根据权利要求1所述的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法，其特征在于，所述av1质粒的gvi蛋白由噬菌体休克启动子ppsp启动。

3.根据权利要求1所述的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法，其特征在于，所述诱变质粒aemp由ppsp启动子启动。

4.根据权利要求1所述的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法，其特征在于，所述携带f因子的大肠杆菌为fm15，基因型为f’proa+b+laci qδ(lacz)m15 zzf::tn10(tetr)/λ–ilvg–rfb-50rph-1attb::kan rδ(lacz)m15。

5.根据权利要求1所述的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法，其特征在于，m9培养基配方中可溶性淀粉的浓度随着进化逐步降低以增加筛选压力。

6.采用权利要求1～5任意一项所述的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法进化得到的淀粉酶突变体。

7.采用权利要求1～5任意一项所述的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法进化得到的淀粉酶突变体的表达载体，包括所述淀粉酶突变体的突变位点或突变位点的组合。

8.采用权利要求1～5任意一项所述的噬菌体与宿主共生进化淀粉酶的方法进化得到的淀粉酶突变体在生物学上的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种噬菌体与宿主共生的进化淀粉酶的方法及应用。所述方法以野生型SP‑amyC作为噬菌体，将AV1质粒、诱变质粒AEMP共转化携带F因子的大肠杆菌得到宿主菌，在以淀粉为唯一碳源的M9培养基中生长；AV1质粒辅助表达gVI蛋白，核酸序列如SEQ ID No.2所示；诱变质粒AEMP核酸序列如SEQ ID No.3所示；野生型SP‑amyC核酸序列如SEQ ID No.4所示。当噬菌体SP‑amyC侵染大肠杆菌后，噬菌体上的淀粉酶基因表达淀粉酶，淀粉酶水解软琼脂上的唯一碳源淀粉产生小分子麦芽寡糖为大肠杆菌提供生长所需能量，新产生的子代大肠杆菌又继续被子代噬菌体继续侵染，以此循环共生。相对传统进化方法，本发明更加高效便捷，不用建库及大量的人工筛选，成本低廉，人为干预极少。

技术研发人员：李小明,崔金明,刘陈立,李阳源
受保护的技术使用者：广州先进技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13