一种tac启动子突变文库及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种tac启动子文库及其中包含的启动子，包含所述启动子的载体和/或宿主细胞、该启动子文库的构建方法以及启动子活性的筛选方法及其应用。

背景技术：

1、启动子是转录层面调控细胞代谢的最重要元件。启动子是指一段特定的非编码dna序列，通常位于转录起始位点上游100-1000bp范围内。对于原核生物而言，完整的启动子结构包括上游调节序列和核心区。其中，核心区包括-10区和-35区，指转录起始位点(+1)上游大约10个及35个核苷酸处的两段dna序列，对于sigma因子的识别和结合具有重要的作用(于慧敏、郑煜堃、杜岩等，合成生物学研究中的微生物启动子工程策略[j]，合成生物学,2021,2(4):598.)。其中，-10区和-35区序列的碱基组成以及两个区域之间的序列长度对调节转录过程至关重要。

2、在过去的十几年间，代谢工程高度依赖于便捷、高效启动子的挖掘和表征。然而，微生物内源性启动子数量有限，且具有一定的局限性：1)内源启动子往往具有基因特异性；2)内源启动子无法具有梯度强度，不能对目标基因进行精确的“开量式”微调。3)内源启动子往往强度不够，其转录的目的基因往往无法达到最大转录量等等。

3、tac启动子是模式生物中应用最广泛的诱导型启动子之一。它是由trp启动子和lacuv5启动子构建的杂合启动子，可以被lac阻遏蛋白抑制，受β-异丙基硫代半乳糖苷(iptg)的诱导。研究表明，在大肠杆菌中，tac启动子-10区和-35区间隔长度为16nt或17nt时转录强度最高。而在谷氨酸棒杆菌中，还未有针对tac启动子间隔序列进行改造的报道。为丰富模式微生物谷氨酸棒杆菌的合成生物学元件，实现对不同基因的“开量式”微调，本领域需要开发一个具有梯度强度的tac启动子文库，实现对不同外源基因的精准可控表达，更好的满足工业生产需求。

技术实现思路

1、考虑到-10区和-35区间隔序列的碱基组成及长度、5’末端非翻译区的长度均会影响启动子的转录强度，本发明构建了基于原始tac启动子的突变文库，构建了一系列具有梯度转录强度的iptg诱导型启动子，并成功设计构建了启动强度超强的ptacm26突变体。

2、具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题。

3、1.一种启动子文库，所述启动子文库包括至少2个启动子，其中所述启动子包含如下结构：

4、(1)自5’端开始的上游调节序列ggcaaatattctgaaatgagctg；

5、(2)-35区序列ttgaca和-10区序列tataatg；

6、(3)在-35区和-10区之间长度为12-20个核苷酸的第一间隔序列；

7、(4)laco操纵序列ttgtgagcggataacaa；

8、(5)在-10区和laco操纵序列之间长度为4-10个核苷酸的第二间隔序列；和

9、(6)在laco操纵序列3’端长度为0-51个核苷酸的5’非翻译区(5’utr)序列。

10、2.根据项1所述的启动子文库，其中所述第一间隔序列的长度为13-18个碱基，优选为14-17个，更优选为15-16个核苷酸。

11、3.根据项1或2所述的启动子文库，其中所述第二间隔序列的长度为5-9个碱基，优选为6-8个，更优选为7个核苷酸。

12、4.根据项1-3中任一项所述的启动子文库，其中所述第二间隔序列为tgtggaa。

13、5.根据项1-4中任一项所述的启动子文库，其中所述5’utr序列的长度为20-45个碱基，优选为25-40个核苷酸，更优选为28-35个核苷酸。

14、6.根据项1-5中任一项所述的启动子文库，其中所述启动子文库包括选自seq idno.1-seq id no.26中的至少5个启动子、至少8个启动子、至少10个启动子、至少12个启动子、至少15个启动子、至少18个启动子、至少20个启动子、至少22个启动子、至少25个启动子、或全部26个启动子。

15、7.根据项1-6中任一项所述的启动子文库，其中所述启动子文库包括seq idno.1-seq id no.26所示的启动子或由所述启动子组成。

16、8.一种tac启动子的突变体，其核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.26中的任一个所示。

17、9.根据项8所述的突变体，其核苷酸序列如seq id no.26所示。

18、10.一种载体，所述载体含有根据项1-7中任一项所述的启动子文库中的启动子或者根据项8或9所述的突变体。

19、11.根据项10所述的载体，其中所述载体是通过选自下组的载体构建的：pec-xk99e，pxmj19，pxz10145和pxt01。

20、12.一种细胞，所述细胞包含根据项1-7中任一项所述的启动子文库中的启动子、根据项8或9所述的突变体或者根据项10或11的载体。

21、13.根据项12所述的细胞，所述细胞的基因组中整合有根据项1-7中任一项所述的启动子文库中的启动子或者根据项8或9所述的突变体。

22、14.根据项12或13所述的细胞，所述细胞选自下组：埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、红球菌属。

23、15.根据项14所述的细胞，所述细胞选自下组：大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌属、枯草芽孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、红色红球菌(有时也译作赤红球菌)。

24、16.一种利用项1-7中任一项所述的启动子文库进行目的基因表达调控的方法，其包括：使用所述启动子文库中的任意一种启动子转录目的基因，或者将目的基因连接到含有所述启动子文库中的任意一种启动子的表达载体上，并将所得到的载体转入宿主细胞中进行表达。

25、17.根据项16所述的方法，其中所述目的基因选自编码具有特定功能的蛋白的结构基因或者报告基因。

26、18.根据项16或17所述的方法，所述目的基因选自下组：细胞分裂调节基因ftsz、β-半乳糖苷酶基因、绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因和荧光素酶基因。

27、19.一种基于启动子强度对启动子进行筛选的方法，其包括对项1-7中任一项所述的启动子文库中的不同启动子启动目的基因表达的能力与野生型tac启动子进行比较从而确定启动子的强度，并根据启动子的强度筛选出具有合适强度的启动子。

28、20.根据项1-7中任一项所述的启动子文库用于在转录水平对目的基因的表达进行微调中的用途。

29、为使本发明所述的技术方案更加清晰，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步的说明。

技术特征：

1.一种启动子文库，所述启动子文库包括至少2个启动子，其中所述启动子包含如下结构：

2.根据权利要求1所述的启动子文库，其中所述第一间隔序列的长度为13-18个碱基，优选为14-17个，更优选为15-16个核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的启动子文库，其中所述第二间隔序列的长度为5-9个碱基，优选为6-8个，更优选为7个核苷酸。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的启动子文库，其中所述第二间隔序列为tgtggaa。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的启动子文库，其中所述5’utr序列的长度为20-45个碱基，优选为25-40个核苷酸，更优选为28-35个核苷酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的启动子文库，其中所述启动子文库包括选自seqid no.1-seq id no.26中的至少5个启动子、至少8个启动子、至少10个启动子、至少12个启动子、至少15个启动子、至少18个启动子、至少20个启动子、至少22个启动子、至少25个启动子、或全部26个启动子。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的启动子文库，其中所述启动子文库包括seq idno.1-seq id no.26所示的启动子或由所述启动子组成。

8.一种tac启动子的突变体，其核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.26中的任一个所示。

9.根据权利要求8所述的突变体，其核苷酸序列如seq id no.26所示。

10.一种载体，所述载体含有根据权利要求1-7中任一项所述的启动子文库中的启动子或者根据权利要求8或9所述的突变体。

11.根据权利要求10所述的载体，其中所述载体是通过选自下组的载体构建的：pec-xk99e，pxmj19，pxz10145和pxt01。

12.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1-7中任一项所述的启动子文库中的启动子、根据权利要求8或9所述的突变体或者根据权利要求10或11的载体。

13.根据权利要求12所述的细胞，所述细胞的基因组中整合有根据权利要求1-7中任一项所述的启动子文库中的启动子或者根据权利要求8或9所述的突变体。

14.根据权利要求12或13所述的细胞，所述细胞选自下组：埃希氏菌属(escherichia)、棒杆菌属(corynebacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、红球菌属(rhodococcus)。

15.根据权利要求14所述的细胞，所述细胞选自下组：大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌属(corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌属(bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amylolyticus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、红色红球菌(rhodococcus ruber)。

16.一种利用权利要求1-7中任一项所述的启动子文库进行目的基因表达调控的方法，其包括：使用所述启动子文库中的任意一种启动子转录目的基因，或者将目的基因连接到含有所述启动子文库中的任意一种启动子的表达载体上，并将所得到的载体转入宿主细胞中进行表达。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述目的基因选自编码具有特定功能的蛋白的结构基因或者报告基因。

18.根据权利要求16或17所述的方法，所述目的基因选自下组：细胞分裂调节基因ftsz、β-半乳糖苷酶基因、绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因和荧光素酶基因。

19.一种基于启动子强度对启动子进行筛选的方法，其包括对权利要求1-7中任一项所述的启动子文库中的不同启动子启动目的基因表达的能力与野生型tac启动子进行比较从而确定启动子的强度，并根据启动子的强度筛选出具有合适强度的启动子。

20.根据权利要求1-7中任一项所述的启动子文库用于在转录水平对目的基因的表达进行微调中的用途。

技术总结
本发明涉及一种tac启动子文库及其应用。本发明通过改变tac启动子核心区间隔序列的长度、碱基组成以及5’末端非翻译区的长度，构建了一系列具有梯度转录强度的启动子。在此基础上，通过对上述不同区域的最优序列进行组合，构建了一个超强启动子PtacM26。本发明文库中的启动子具有较宽的转录强度范围，能够实现对不同基因的“开量式”微调。

技术研发人员：于慧敏,王苗苗,杜岩,陈博
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13