一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法

1.本发明属于植物转基因技术领域，具体的说，涉及一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法。


背景技术：

2.植物遗传转化(plant genetic transformation)是应用dna重组技术，将外源基因或dna片段导入植物基因组，并使其稳定遗传和表达的技术，是植物基因工程的核心技术。植物的遗传转化技术大致可以分为三类：
①
载体介导转化法，主要有农杆菌ti质粒和ri质粒、植物病毒、人工染色体、rna病毒、类病毒、线粒体dna、叶绿体dna、核复制子、s1类质粒等都可以作为植物遗传转化的载体系统。
②
dna直接导入法，主要有基因枪法、电击法、peg法、脂质体法、微束激光穿刺法、碳化硅纤维介导法、超声波法以及显微注射法。
③
种质系统转化法（germ line transformation），也叫生物媒体转化系统，即借助生物自身的种质细胞为媒体，特别是植物生殖系统细胞以及细胞自身结构来实现外源基因转化的系统。包括花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊与子房注射法、萌发种子转化法等。本发明中的原位遗传转化法也即萌发种子转化法。
3.现有技术，对拟南芥原位遗传转化法的研究不够系统且不够深入，表现为遗传转化率较低，导致其应用程度大大受限。
4.因此，有必要开发一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，以提高拟南芥的遗传转化效率，有助于扩大其在基因编辑突变体株筛选中的应用前景。


技术实现要素：

5.为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化法，通过对原位遗传转化过程中，包括预培养时间、超声波处理时间、农杆菌od值，真空抽滤时间在内的重要影响因素进行优化，并且通过超声波处理和真空抽滤相结合的辅助方式，配合其它相关实施条件及步骤，最终实现gus报告基因在转化株中的高效稳定表达，转化率可达到68%，具有显著提升。同时本方法不依赖于组织培养途径、不受限于植物基因型，操作更为简便。
6.为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：所述的高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法包括以下步骤：种子灭菌及预培养：对拟南芥种子进行灭菌后，使用1/2 ms固体培养基对灭菌后的种子进行萌发预培养2-6天，所述1/2 ms固体培养基通过在1/2 ms液体培养基中加入琼脂粉制成；（2）将步骤（1）中预培养的种子进行超声波处理；（3）农杆菌重悬液制备；（4）将步骤（2）中经过超声波处理的种子通过步骤（3）中制备的农杆菌重悬液在真空条件下进行农杆菌侵染；（5）将步骤（4）中经过侵染的种子与农杆菌进行共培养；（6）将步骤（5）中经过共培养的种子进行脱菌清洗后移栽；（7）阳性株系筛选与鉴定：使用basta除草剂对拟南芥转化株进行初筛，之后再取其叶片进行gus组织化学染色和gus目的基因的pcr鉴定；（8）纯系抗性筛选:收获步骤（7）
筛选的转基因株系的t0代种子，播种于含有basta除草剂的1/2 ms固体培养基进行抗性筛选，再对抗性筛选的种子进行移栽，收获t1代种子再播种于含有basta除草剂的1/2 ms固体培养基进行抗性筛选，筛选获得t2代单株纯系种子。
7.作为优选，步骤（1）中种子灭菌具体操作为：分装拟南芥种子于离心管中，用ddh2o对其进行清洗，洗掉杂质，控干水分后加入75 %酒精浸泡种子45 s，再用ddh2o清洗掉残余酒精，之后用含有tween-20的10 %的次氯酸钠溶液浸泡种子15 min，浸泡期间摇匀3～4次，再用ddh2o清洗种子，控干水分备用。
8.作为优选，所述每升1/2 ms液体培养基中加入7g琼脂粉。通过在1/2 ms液体培养基中加入琼脂粉，调节1/2 ms培养基的软硬度，防止1/2 ms培养基过硬影响种子萌发；防止1/2 ms培养基过软，在种子转移过程中容易将培养基戳破，影响种子移出，并且容易造成污染。
9.作为优选，种子预萌发培养条件为：光照强度为700 μmol/m2·
s，23-27 ℃，14 hrs光照/10 hrs黑暗。
10.作为优选，步骤（2）中超声波处理具体操作为：收集预培养后的种子，装入盛有1/2 ms液体培养基的容器中，放入超声波仪处理槽内处理1-3 min，功率为100 %，工作频率为53 khz。
11.作为优选，步骤（3）中农杆菌重悬液制备具体操作为：挑取农杆菌单克隆进行活化后，取100 ul活化菌液至50 ml yeb培养基中进行扩大培养至od
600
值0.9-1.5，然后于4 ℃离心收集菌体。再用30 ml含5%蔗糖和150 μm乙酰丁香酮的 1/2 ms液体培养基进行菌体重悬，静置1 h待用。
12.作为优选，步骤（4）中农杆菌侵染具体操作为：在农杆菌重悬液中加入0.2 %的silwett l-77，混匀后，将超声处理后的种子转移至装有农杆菌重悬液的容器中，通过真空泵对容器进行真空抽滤5-10 min，然后将容器封口并在120 rpm的条件下震荡培养20 min。
13.作为优选，步骤（5）中共培养条件为：使用含150 μm乙酰丁香酮的1/2 ms固体培养基，在23-27 ℃条件下黑暗共培养3天。
14.作为优选，步骤（6）中脱菌清洗后移栽的具体操作为：将经过共培养处理的种子用含200 mg/l头孢霉素的ddh2o清洗，之后在无菌滤纸上控干，再将其直接移栽至装有经灭菌处理的栽培基质中，浇足水后覆盖上保鲜膜并置于植物光照培养箱中生长，培养条件为21 ℃，16 hrs光照/8 hrs黑暗，光照强度700 μmol/ m2·
s，2-3天后揭膜，置于生长箱中正常养护。
15.作为优选，所述栽培基质中含草炭土和珍珠岩，草炭土与珍珠岩按重量计比例为8:1。
16.本发明的有益效果：1、本发明操作简便，可有效提高拟南芥遗传转化率，实现gus报告基因在转化株中的高效稳定表达。
17.2、本发明的外植体类型为萌发种子，获取及制备均较为简便，转化过程中可通过增加外植体数量一次性获得较多的转化株系，应用于基因编辑突变体植株筛选中可进一步提高其筛选时效。
附图说明
18.图1是本发明操作步骤流程图图2是拟南芥t2代纯系遗传转化株各组织部分gus组织化学染色图，其中，左上为幼苗，右上为萌发花序芽，左下为花序，右下为4周苗龄的植株图3是拟南芥gus阳性转化株的gus报告基因pcr检测结果，其中l1~l18分别代表不同gus阳性转化株，ck为野生型对照株，pcr扩增所用引物为35 s上游引物和gus基因下有引物，目的片段长度为524 bp图4是不同浓度的basta除草剂喷施野生型拟南芥植株的使用效果。
具体实施方式
19.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合附图，对本发明具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
20.本发明选用了columbia野生型拟南芥种子研究对象，dna质粒为pcambia3301，农杆菌为eha105，yeb培养基中kana含量为100 mg/l，rif含量为50 mg/l。
21.本发明使用剪掉约3 mm头部的1 ml移液吸头配合移液枪进行种子转移，使用酒精灯封闭吸头出口使其变圆，将种子尽量拨开铺设于培养基上进行培养。
22.本发明剪取4-5周龄的拟南芥莲座叶进行gus组织化学染色和dna提取，将叶片染出蓝色（如图2）且dna模板能扩增出gus报告基因目的条带（如图3）的株系视为转基因植株。
23.如图2所示，拟南芥t2代纯系遗传转化株组织化学染色效果比较明显，证明经过本发明方法进行原位遗传转化的拟南芥转化株gus报告基因在转化株中的高效稳定表达。
24.实施例1本实施例将拟南芥分装于离心管中，用ddh2o对其进行清洗，洗掉杂质，控干水分后加入75 %酒精浸泡种子45 s，再用ddh2o清洗掉残余酒精，之后用含有tween-20的10 %的次氯酸钠溶液浸泡种子15 min，浸泡期间摇匀3～4次，再用ddh2o清洗种子，控干水分备用。然后在光照强度为700 μmol/m2·
s，23-27 ℃，14 hrs光照/10 hrs黑暗的条件下，使用1/2 ms固体培养基对灭菌后的种子进行萌发预培养4天；收集预培养后的种子，装入盛有1/2 ms液体培养基的容器中，放入超声波仪处理槽内，在功率100 %，工作频率53 khz条件下，处理1 min；本实施例中农杆菌重悬液挑取农杆菌单克隆进行活化后，取100 ul活化菌液至50 ml yeb培养基中进行扩大培养至od
600
值1.5，然后于4 ℃离心收集菌体。再用30 ml含5%蔗糖和150 μm乙酰丁香酮的 1/2 ms液体培养基进行菌体重悬，静置1 h待用；在农杆菌重悬液中加入0.2 %的silwett l-77混匀后，将超声处理后的种子转移至装有农杆菌重悬液的容器中，通过真空泵对容器进行真空抽滤5 min，然后将容器封口并在120 rpm的条件下震荡培养20 min；使用含150 μm乙酰丁香酮的1/2 ms固体培养基，对侵染后的种子在23-27 ℃条件下与农杆菌黑暗共培养3天；将经过共培养处理的种子用含200 mg/l头孢霉素的ddh2o清洗，之后在无菌滤纸上控干，再将其直接移栽至装有经灭菌处理的栽培基质中，浇足水后覆盖上保鲜膜并置于植物光照培养箱中生长，培养条件为21 ℃，16 hrs光照/8 hrs黑暗，光照强度700 μmol/ m2·
s，2-3天后揭膜，置于生长箱中正常养护；转化苗于生长箱中生长10天后，对拟南芥转化株喷施10 mg/l的basta除草剂（每三天喷施一次，连续喷施3次）进行初筛，10 mg/l的basta除草剂已达到拟南芥致死浓度（如图4），待拟南芥初筛植株
抽薹后（苗龄约4-5周），剪取莲座叶进行gus组织化学染色和gus目的基因的pcr鉴定，并根据结果计算遗传转化率s1；根据染色及鉴定结果收获转基因株系t0代种子，播种于含有basta除草剂的1/2 ms固体培养基平皿中进行抗性筛选，10天后移栽抗性植株于栽培基质中，收获其t1代种子，再进行下一代种子的抗性筛选，最终收获t2代单株纯系种子。
25.实施例2本实施例采用与实施例1相似的步骤进行，所不同的是：农杆菌培养至od
600
值1.2，真空泵对容器进行真空抽滤10 min，计算遗传转化率为s2。
26.实施例3本实施例采用与实施例1相似的步骤进行，所不同的是：萌发预培养时间为6天，超声波处理时间为3 min，计算遗传转化率为s3。
27.实施例1、实施例2、实施例3的遗传转化率结果如表1所示：表1通过表1可以看出，采用本发明对拟南芥实施原位遗传转化，可以有效提升转化率，其中，最优条件预培养4天，超声波处理1 min，农杆菌od
600
值1.5，真空抽滤5 min下，转化率可达到68 %。
28.最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。