高效核酸酶生产酵母工程菌的构建及应用的制作方法

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体地涉及一种高效核酸酶生产酵母工程菌的构建及应用。

背景技术：

1、随着生物医药的发展，重组蛋白在制药工业上运用越来越广泛，不仅能直接用于治疗，也是关键的生物试剂，是创新药研发的核心原料。利用微生物生产重组蛋白是一种经济、高效的方式，但在微生物生产重组蛋白的过程中仍然会存在很多难题。比如：在细胞内重组表达目的蛋白的过程中，核酸就是一类常见的杂质分子，它不仅能增加裂解液的粘度，影响下游的纯化层析；过量的核酸还将导致纯化产品的核酸污染，从生物制药的角度来说，一定长度的宿主dna片段残留具有致癌的风险。所以在重组蛋白生产过程中，控制核酸的含量至关重要。

2、来源于灵杆菌的商品化核酸酶(例如benzonase核酸酶)由于具有较高的催化效率，是生物化学和药物制剂领域重要的核酸污染控制用酶。目前，核酸酶的重组表达多在原核系统中进行，然而核酸酶的细胞内重组表达往往存在对宿主细胞的高毒性，从而导致宿主很难生长或者以无活性的包涵体形式表达。有研究(例如cn113234704a)表明通过加入可溶标签解决部分包涵体问题，但是这样的操作会引入标签蛋白，导致重组蛋白的比酶活偏低。另外一些研究(例如us5173418a)尝试使用大肠杆菌分泌表达，但由于分泌效率较低，仍无法有效解决胞内产物难以收获和纯化的问题。此外，由大肠杆菌引入的内毒素也增加了后续对蛋白的纯化操作上的难度。也有研究(例如cn109852633a)表明可以使用芽孢杆菌进行分泌表达核酸酶，但因存在潜在的污染风险，不易放大生产。因而，利用原核系统表达核酸酶存在较大技术障碍。

3、仍需要一种改进的核酸酶生产系统，其能够克服传统表达系统对宿主细胞毒性高、核酸酶比酶活低、后续纯化步骤繁琐等问题，提供高效核酸酶生产。

技术实现思路

1、发明人经长期研究发现并构建了一种高效核酸酶生产酵母工程菌。该酵母工程菌能够克服核酸酶表达对宿主细胞的毒性问题，以高分泌效率生产高效核酸酶，且易于纯化，具有广阔的应用前景。

2、一方面，本文提供一种源自灵杆菌核酸酶的变体核酸酶，其具有seq id no:2所示氨基酸序列。

3、另一方面，本文提供所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

4、另一方面，本文提供一种酵母表达载体，其含有本文所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

5、另一方面，本文提供一种宿主细胞，其选自：

6、(a)染色体中整合有所述变体核酸酶的编码多核苷酸的细胞；和

7、(b)含有所述酵母表达载体的细胞。

8、另一方面，本文提供一种酵母工程菌，其包含所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

9、另一方面，本文提供一种构建酵母工程菌的方法，其包括：将所述变体核酸酶的编码多核苷酸引入酵母菌。

10、另一方面，本文提供一种制备所述变体核酸酶的方法，其包括：

11、(i)在适于表达的条件下，培养本文所述的酵母工程菌，使其表达所述变体核酸酶；和，

12、(ii)从所述酵母工程菌的培养物纯化变体核酸酶。

13、另一方面，本文提供所述变体核酸酶用于控制核酸污染的用途。

1.一种源自灵杆菌核酸酶的变体核酸酶，其具有seq id no:2所示氨基酸序列。

2.编码如权利要求1所述的变体核酸酶的多核苷酸。

3.一种酵母表达载体，其含有如权利要求2所述的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的酵母表达载体，其含有α-因子信号肽编码序列。

5.一种宿主细胞，其选自：

6.一种酵母工程菌，其包含如权利要求2所述的多核苷酸；

7.一种构建酵母工程菌的方法，其包括：将如权利要求2所述的多核苷酸引入酵母菌；

8.一种制备如权利要求1所述的变体核酸酶的方法，其包括：

9.如权利要求8所述的方法，其中：所述纯化包括对步骤(ii)中收集的上清液进行过滤、超滤、渗滤、离子交换中的一项或多项操作；

10.如权利要求1所述的变体核酸酶用于控制核酸污染的用途。