一种靶向BAFFR嵌合抗原受体、CAR-T细胞及应用的制作方法

本发明属于生物医药和分子生物学，具体涉及一种靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞及应用。

背景技术：

1、本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、淋巴瘤在新诊断的恶性肿瘤中占5％。淋巴瘤主要有两种类型：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(nhl)。这些可以通过病理组织学进行鉴别，淋巴瘤的初步诊断是基于reed-sternberg细胞的存在与否。如果存在这些细胞，淋巴瘤归为霍奇金淋巴瘤；如果不存在这些细胞，淋巴瘤则归为非霍奇金淋巴瘤。事实上，90％的淋巴瘤都是非霍奇金淋巴瘤，包括一系列淋巴细胞增殖性恶性肿瘤，受影响的淋巴细胞异常增殖和在淋巴系统的某些部分积累。研究者通过细胞免疫表型检测来确定nhl是来自b细胞(85％的病例)还是来自t细胞和自然杀伤(nk)细胞(15％的病例)。通过病理组织学考虑其结构(滤泡性或弥漫性)和形态(小细胞或大细胞)。通过临床表现进行分类，当淋巴瘤细胞出现缓慢分裂时，nhl是低度或惰性的，这意味着nhl的发展持续时间较长，常见的惰性非霍奇金淋巴瘤有滤泡性淋巴瘤(fl)、套细胞淋巴瘤(mcl)；当淋巴瘤细胞以更快的速度分裂时，nhl是高级别或侵袭性的，最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤有弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、burkitt淋巴瘤。

3、细胞活化因子受体(baffr)是一种b系标记物，仅在前体b细胞期之后和浆细胞期发育之前表达，包括恶性b细胞。baffr的表达是正常b细胞存活的关键。这些特征可能因此限制恶性b细胞通过下调来逃避baffr免疫治疗的能力。靶向cd19的car-t细胞为b细胞恶性肿瘤的治疗提供了有前途的选择。然而，由于抗原丢失导致的肿瘤复发会限制疗效。已有研究者开发了baffr car-t细胞，显示了对人淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病(all)株系的细胞毒性。并在体外和小鼠模型中测试了baffr car-t细胞治疗人类淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病，并与cd19 car-t细胞进行了比较。过继转移的baffr car-t细胞在单次治疗后根除了10天前建立的肿瘤异种移植物，并对cd19表达缺陷的异种移植物保持了疗效，包括cd19阳性淋巴瘤细胞背景中的cd19阴性变异。4例cd19靶向治疗后cd19抗原丢失的原发性复发all保留了baffr表达和活化的baffr，但没有cd19 car-t细胞。baffr car-t细胞可用于淋巴瘤治疗，其靶向还可能防止cd19抗原丢失变异的出现。

4、baffr符合理想靶抗原的特点，即在靶细胞表面高度一致性表达，在正常组织低表达，差异化的表达模式可减少脱靶(肿瘤外)毒性。因此，baffr被认为是非霍奇金淋巴瘤的合适靶标，用于开发car-t细胞免疫治疗。

技术实现思路

1、针对现有技术，本发明的目的在于提供一种靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞及应用。本发明提供的抗baffr蛋白的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，通过靶向肿瘤细胞表面的baffr蛋白并激活t细胞下游的信号通路，赋予t细胞杀伤带有baffr靶点肿瘤细胞的能力，并且能够加强car-t的增殖和杀伤肿瘤的能力，可高效特异的治疗baffr阳性非霍奇金淋巴瘤。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

3、本发明的第一个方面，提供一种靶向baffr的嵌合抗原受体，其至少包含依次串联的信号肽、抗原结合结构域、嵌合受体跨膜区、共刺激信号传导域和信号传导结构域；

4、所述抗原结合结构域为抗baffr抗体；

5、其中，所述抗baffr抗体的氨基酸序列选自：

6、a1)如seq id no.13或15所示的氨基酸序列；或，

7、a2)如seq id no.13或15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

8、根据本发明，所述嵌合抗原受体由cd8α信号肽、结合baffr抗原的抗原结合结构域、cd8铰链区、cd8跨膜区、4-1bb共刺激信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域串联而成。

9、本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包括编码上述靶向baffr的嵌合抗原受体的核苷酸。

10、所述核酸分子依次包括cd8α信号肽的编码基因序列、结合baffr抗原的抗原结合结构域的编码基因序列、cd8铰链区的编码基因序列、cd8跨膜区的编码基因序列、4-1bb共刺激信号传导结构域的编码基因序列和cd3ζ信号传导结构域的编码基因序列。

11、本发明的第三个方面，提供一种重组载体，所述重组载体包含第二方面所述的核酸分子。

12、本发明的第四个方面，提供一种car-t细胞，所述car-t细胞是由上述靶向baffr的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞。本发明为baffr阳性肿瘤特别是非霍奇金淋巴瘤的car-t治疗提供了新的治疗手段。

13、具体的，所述car-t细胞可采用如下方法制备得到，如用慢病毒感染t细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。

14、本发明的第五个方面，提供上述嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、car-t细胞在如下h1)-h4)中任一种或多种中的应用：

15、h1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；

16、h2)治疗或辅助治疗肿瘤；

17、h3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；

18、h4)杀伤肿瘤细胞。

19、本发明的第六个方面，提供一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，所述产品的活性成分可以为上述嵌合抗原受体或上述car-t细胞。

20、所述产品可以为药物。

21、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

22、上述技术方案以baffr蛋白为靶点，从而成功制备一种靶向baffr的抗体，并进一步对其进行人源化设计获得人源化抗体，并构建二代car质粒载体，通过分离t细胞，用编码car的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向baffr的嵌合抗原受体(car)的t细胞，能够特异性识别和清除baffr阳性肿瘤细胞，特别是非霍奇金淋巴瘤，因此具有良好的实际应用之价值。

技术特征：

1.一种靶向baffr的嵌合抗原受体，其特征在于，其至少包含依次串联的信号肽、抗原结合结构域、嵌合受体跨膜区、共刺激信号传导域和信号传导结构域；

2.如权利要求1所述的靶向baffr的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽为cd8α信号肽；

3.如权利要求1所述的靶向baffr的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由cd8α信号肽、结合baffr抗原的抗原结合结构域、cd8铰链区、cd8跨膜区、4-1bb共刺激信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域串联而成。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1-3任一项所述靶向baffr的嵌合抗原受体的核苷酸。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子依次包括cd8α信号肽的编码基因序列、结合baffr抗原的抗原结合结构域的编码基因序列、cd8铰链区的编码基因序列、cd8跨膜区的编码基因序列、4-1bb共刺激信号传导结构域的编码基因序列和cd3ζ信号传导结构域的编码基因序列。

6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含第二方面所述的核酸分子；

7.一种car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞是由权利要求1-3任一项所述靶向baffr的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞。

8.权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体、权利要求4或5所述核酸分子、权利要求6所述重组载体、权利要求7所述car-t细胞在如下h1)-h4)中任一种或多种中的应用：

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述肿瘤为baffr阳性的肿瘤；所述baffr阳性的肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤。

10.一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，其特征在于，所述产品的活性成分为权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体或权利要求7所述car-t细胞。

技术总结
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向BAFFR嵌合抗原受体、CAR‑T细胞及应用。本发明以BAFFR蛋白为靶点，从而成功制备一种靶向BAFFR的抗体，并进一步对其进行人源化设计获得人源化抗体，并构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向BAFFR的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，能够特异性识别和清除BAFFR阳性肿瘤细胞，特别是非霍奇金淋巴瘤，因此具有良好的实际应用之价值。

技术研发人员：孙卫平,张丹丹
受保护的技术使用者：济南泰和医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12