磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法及其应用与流程

本发明涉及分子遗传学，具体涉及一种磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法及其应用。

背景技术：

1、植物遗传转化是认识生命、解析生命现象的重要技术，也是保障现代生物育种、维护国家粮食安全的重要途径。植物遗传转化技术(plant genetic transformationtechnology)是一种以植物器官、组织、细胞或原生质体为受体，通过某技术或途径导入目的基因，并使之在植物中表达，以产生在农艺性状、抗性、营养品质等方面满足人类需求的植物的技术。迄今为止，植物遗传转化技术已取得了长足发展，现已建立起多种模式植物的高效遗传转化体系，例如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、聚乙二醇介导法和电击法等。

2、然而，大多数非模式植物(包括主粮作物)的遗传转化高度依赖基因型，严重阻碍着植物生命规律的解析和生物育种的进步；现行转基因技术多依赖“非转化植物受体来源(非受体源)”的筛选标记等基因元件，这对于下游生物工程产品的释放提出了额外的生物安全评价要求。为此，亟待建立生物安全、无限递送、物种友好的新型植物遗传转化技术体系。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明开创性的提出了一种磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法，通过多细胞体转化、单细胞筛选，再利用细胞全能性建成大量转基因植株，大大提高了植物遗传转化效率和生物安全性，实现了高通量转基因植株的创制。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法，包括以下步骤：

4、(1)利用磁性颗粒携带外源目的基因，通过基因枪法轰击植物转化受体；

5、(2)在植物转化受体被轰击后的第一次细胞分裂周期内，消解植物转化受体的胞间层，获得带壁单细胞或原生质体细胞；或收集被轰击后尚有活性的花粉粒；然后采用磁力分拣收获携带磁性颗粒的带壁单细胞、原生质体细胞或花粉粒；

6、(3)将收获的携带磁性颗粒的带壁单细胞或原生质体细胞通过植物组培再生技术，获得转基因植株；将收获的携带磁性颗粒的花粉粒进行授粉结实。

7、优选的，步骤(1)中，所述磁性颗粒选自细胞友好、大小合适、可包裹核酸的磁性颗粒；所述磁性颗粒包括但不限于：镀金磁性金属颗粒；例如：镀金磁性纳米粒子(moraessilva et al.2016.chemical communications 52:7528-7540)、美国nanocs公司的镀金磁性颗粒(0.5和1μm大小，其表面涂有20-100nm纳米金颗粒层)等。

8、优选的，步骤(1)中，所述植物转化受体包括但不限于：小麦幼胚盾片，疏松型胚性愈伤，小麦、玉米及向日葵成熟花粉粒等。

9、优选的，步骤(2)中，利用胞间层和初生细胞壁的组分差异特异性消解胞间层，获得带壁单细胞。

10、更优选的，利用离析酶和果胶酶处理消解胞间层；或者，采用物理法预处理植物转化受体，然后再用离析酶和果胶酶消化。

11、所述物理法预处理包括：重复冻融、研磨破碎等。

12、本发明的第二方面，提供上述转基因方法在如下(1)或(2)中的应用：

13、(1)构建非模式植物的遗传转化体系；

14、(2)植物育种。

15、上述应用中，所述植物包括但不限于：小麦、玉米、向日葵等。

16、本发明的有益效果：

17、本发明首次提出的磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法，本发明通过多细胞体转化、单细胞筛选，再利用细胞全能性或花粉授精建成大量转基因植株，大大提高了植物遗传转化效率和生物安全性，实现了高通量转基因植株的创制。本发明的方法可以应用于带壁单细胞、花粉粒和原生质体等多种不同对象。

18、具体来说，本发明的技术方案具有如下突出的技术效果：

19、(1)纯目标基因操作、生物安全：

20、植物遗传转化通常涉及工程菌株和质粒，比如农杆菌改良菌株、链霉菌筛选基因、植物病毒基因元件等。当前，人们对于这类转基因植株认知不足、勉强面对。本发明将建立受体源基因的直接导入，从而规避任何应用非受体源基因元件的潜在生物安全风险。以太谷核不育小麦的ms2基因为例，前期曾分离到太谷核不育小麦的ms2自然表达框，然后将其导入冬小麦‘brundage’，获得了小麦源ms2转基因小麦，并表现典型的太谷核不育表型(zhang et al.,2021.cereal research communications 50:191–197)。美中不足的是，该项研究在转化ms2基因片段的同时，一并采用来自链霉菌的抗除草剂bar基因开展共转化，以便筛选ms2和bar基因的共转化事件，获得转基因植株。本发明将变革植物转基因方案：采用基因枪轰击，仅导入受体源目标基因片段，不再使用工程菌株和质粒(包括跨界筛选标记基因)，因此后端转基因植物产品的生物安全性更高。

21、(2)规避化学抑制、转基因单细胞自由生长：

22、植物遗传转化通常依赖转基因筛选试剂(如潮霉素、双丙氨膦等)或agrobacterium抑菌剂(如特美汀、羧苄青霉素)。实践表明，在培养基中添加筛选试剂或抑菌剂对于非转基因细胞有很大毒害，其不良反应及有害分泌物对于周边转基因细胞生长不利，常导致转基因细胞生长缓慢、分化滞后。本发明中，在分离获得转基因单细胞的基础上，后续组培过程不再添加任何转基因筛选试剂或抑菌剂，从而为转基因细胞提供了一个自由宽松的生长乐土，可加速转基因细胞的生长分化及发育。

23、(3)受体广泛、不拘一格：

24、本发明带壁单细胞思路适用于各种植物受体，在保留次生壁的前提下，带壁单细胞更容易生长分化及发育；在规避使用筛选试剂或抑菌剂的前提下，转基因细胞将自由生长。本专利花粉粒思路则适用于玉米、向日葵等产生大量花粉的植物，特别是像玉米这种雌雄异花异位的物种；而对于雌雄同花的物种则最好给雄性核不育母本授粉获得转基因种子。本专利创新思路将大大提高植物遗传转化效率，实现高通量转基因植株的创制。

25、(4)带壁单细胞高效再生：

26、长期以来，大家熟知小麦原生质体的培养再生比较困难：一方面小麦的组培再生能力受基因型限制，另一方面小麦原生质体培养技术相对复杂。相比而言，本发明的带壁单细胞比原生质体更自然、更健全，且具有更好的环境适应性；另外带壁单细胞可以在固体培养基表面生长。

27、(5)不同目标基因片段的顺次及同步递送：

28、本发明采用磁力分拣取代了常规植物筛选标记基因的应用，完美解决了同一受体的依次转化依赖不同筛选标记的弊端。在获得任何目标基因片段的转基因植物的基础上，可以顺次导入第二个、第三个目标基因片段。另外，也可以实现多个目标基因片段的共同导入。

技术特征：

1.一种磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磁性颗粒选自细胞友好、大小合适、可包裹核酸的磁性颗粒；所述磁性颗粒包括但不限于：镀金磁性金属颗粒。

3.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(1)中，所述植物转化受体包括但不限于：小麦幼胚盾片、疏松型胚性愈伤、小麦、玉米和向日葵的成熟花粉粒。

4.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(2)中，利用胞间层和初生细胞壁的组分差异特异性消解胞间层，获得带壁单细胞。

5.根据权利要求4所述的转基因方法，其特征在于，利用离析酶和果胶酶处理消解胞间层；或者，采用物理法预处理植物转化受体，然后再用离析酶和果胶酶消化。

6.根据权利要求5所述的转基因方法，其特征在于，所述物理法预处理包括：重复冻融、研磨破碎等。

7.权利要求1-6任一项所述的转基因方法在如下(1)或(2)中的应用：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于：小麦、玉米、向日葵。

技术总结
本发明公开了一种磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法及其应用，属于分子遗传学技术领域。本发明的方法包括以下步骤：(1)利用磁性颗粒携带外源目的基因，通过基因枪法轰击植物转化受体；(2)在植物转化受体被轰击后的第一次细胞分离周期内，消解植物转化受体的胞间层，获得带壁单细胞或原生质体细胞；或收集被轰击后尚有活性的花粉粒；然后采用磁力分拣收获携带磁性颗粒的带壁单细胞、原生质体细胞或花粉粒；(3)将收获的携带磁性颗粒的带壁单细胞通过植物组培再生技术，获得转基因植株；将收获的携带磁性颗粒的花粉粒进行授粉结实。本发明通过多细胞体转化、单细胞筛选，再利用细胞全能性或花粉授精建成大量转基因植株，大大提高了植物遗传转化效率和生物安全性，实现了高通量转基因植株的创制。

技术研发人员：付道林,郝群群,张会飞,肖艳梅,邹春好,王文强,吴佳洁,倪飞,高荧,许方涛
受保护的技术使用者：泉脉农业科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16