本发明属于生物技术、分子诊断与病毒检测领域，特别涉及运用crispr技术结合石墨烯场效应晶体管(gfet)对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断。
背景技术：
：：1、公开该
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：部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。2、asfv爆发后，为应对疫情，各国研发者利用基因敲除重组技术研发出一系列缺失某个毒力基因或者是免疫调控基因的疫苗株，例如cd2v和mgf基因缺失株。但是近期发现一些基因缺失的弱毒株-疫苗株发生毒力返强事件，这些疫苗株使猪重新患上疾病。因此，需要一种检测技术对asfv强弱毒株进行区别诊断，便于养殖场精准防控疫病感染，减少损失。3、crispr/cas12a technology combined with immunochromatographic stripsfor portable detection of african swine fever virus.期刊：communicationsbiology.4、原理：crispr-cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，构成了针对外来入侵核酸的获得性免疫系统，其防御过程包括三个阶段：间隔序列获取，合成crrna和靶标干扰。通常，crispr-cas系统由crispr rna(crrna)和cas蛋白组成，crrna与靶序列互补，可引导cas蛋白进行序列特异性识别和切割。在大多数靶向dna的crispr-cas系统中，cas蛋白与靶标dna的结合取决于crrna引导的cas蛋白对原型间隔子相邻基序(pam)的识别，其中pam序列是与原型间隔子靶标位点相邻的短dna序列，一般为3-5bp，而不同的crispr-cas蛋白具有不同的pam序列。cas12a在crrna的引导下，识别富含t的靶标dna，切割形成粘性末端，基于此原理，利用u6启动子，获得crrna从而可进行基因编辑和检测。当cas12a识别靶标dna后，cas12a/crrna/dna形成三元复合物被激活切割体系内的ssdna。三元复合物在37℃下非常稳定，甚至在孵育24小时后仍继续切割ssdna。该技术具有操作简单、高灵敏性、高特异性和无需大型仪器设备等优点，在病原检测方面有很大的发展潜力。5、石墨烯是一种六方点阵蜂窝状结构的二维(2d)材料，由sp2杂化碳原子相互连接构成。石墨烯具有双极性特性，外源电子掺杂会导致gfet狄拉克点向左移动，外源空穴掺杂会导致gfet狄拉克点向右移动。外源掺杂的改变使得gfet狄拉克点产生不同方向的移动。由于gfet优异的导电、导热性能、光学性能及机械性能，使其成为集成电路、场效应晶体管、光电器件及传感器的热门材料。场效应晶体管是较新型的半导体材料，通过控制输入回路的电场来控制输出回路电路。要得到高速晶体管的基本条件就是高载流子迁移率的沟道材料，高速晶体管应对输入电压的变化响应迅速，沟道越短，响应越快。6、目前，crispr-cas12检测系统已经表现出来其在检测病毒方面的优越性，但目前尚无运用crispr技术结合gfet检测asfv强弱毒株的切实可行并有效的方案。技术实现思路1、为了解决上述问题，本发明提供了一种crispr结合gfet检测系统，用于与cas12a进行asfv检测。在此系统中，本发明创造性地对gfet表面进行疏水化处理，极大的提高了gfet的稳定性，报告探针通过1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺(pbase)(一种用作探针接头的有效界面偶联剂)充分结合在gfet表面，造成gfet表面发生迪拉克点位移现象。本发明创造性的设计出一段crrna特异性结合待检测目标片段与cas12a蛋白形成复合体，激活cas12a的切割活性，开始对体系内的dna进行普遍性的切割，将crrna，cas12a和目标片段加入结合了探针的gfet上一起孵育1h，迪拉克点发生往回移动现象，表明待检测样本为阳性样本，目标dna使cas12a发挥活性，将gfet表面的探针dna部分切除。值得一提的是，报告探针由接近gfet的6个dna和远离gfet的16个rna和组成。原理上，只要报告探针中的一个dna被降解，至少16个rna就可以被从gfet表面去除。由于gfet优良的导电性能，当crrna与目标片段结合越多，迪拉克点发生往回移动现象愈加明显，依据此理论可以明确辨别出待检测样本是否为疫苗株或者野生毒株。2、需要说明的是，本申请中所述方法不涉及疾病的诊断和治疗。3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：4、本发明的第一个方面，提供了一种运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断的方法，包括：5、制备gfet；6、将报告探针修饰并固定化在所述gfet上，得到crispr结合gfet检测系统；7、提取pet-32a-asfv-p72质粒，稀释为多个不同的浓度梯度；8、将待检测dna、crrna与cas12a及其缓冲液添加到所述crispr结合gfet检测系统中，在37℃条件下孵育，观察迪拉克点位移情况，建立迪拉克点回移程度与模板dna的浓度的对应关系。9、本发明的第二个方面，提供了一种运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟强弱毒株鉴别诊断的方法，包括：10、制备gfet；11、将报告探针修饰并固定化在所述gfet上，得到crispr结合gfet检测系统；12、提取pet-32a-asfv-p72/cd2v/mgf质粒，将其定量保持在同一浓度；13、将不同种的模版dna、crrna与cas12a及其缓冲液组成反应体系；14、将各个所述反应体系分别添加到所述crispr结合gfet检测系统中，在37℃条件下孵育，观察狄拉克点位移情况。15、本发明的有益效果16、crispr结合gfet检测系统检测asfv强弱毒株具有以下4个优点。17、第一：快速，整个反应过程在30min之内；18、第二：简便，反应更易于设计和简化；19、第三：低成本，每次检测仅需0.61美元；20、第四：更适合即时检测(poct)，具有较高的稳定性，可以准确鉴定asfv强弱毒株。技术特征：1.一种运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断方法，其特征在于，包括：2.如权利要求1所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断方法，其特征在于，所述报告探针的序列如seq id no.4所示：3.如权利要求1所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断方法，其特征在于，提取pet-32a-asfv-p72质粒，并依次稀释为100am，10am，1am，0.5am，0.1am浓度梯度。4.如权利要求1所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断方法，其特征在于，反应体系中，5μl每个crrna,5μl buffer,36μl rnase-free water,1μl cas12a和5μl模板dna。5.如权利要求1所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断方法，其特征在于，石墨烯的处理方法包括：6.一种运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟强弱毒株鉴别诊断方法，其特征在于，包括：7.如权利要求6所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟强弱毒株鉴别诊断方法，其特征在于，分为两批，包括：1)模板dna固定，crrna分五种情况加入，pbs，p72-crrna，p72-crrna+cd2v-crrna，p72-crrna+mgf-crrna，p72-crrna+cd2v-crrna+mgf-crrna，其余试剂不变；8.如权利要求6所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟强弱毒株鉴别诊断方法，其特征在于，p72-crrna的序列如seq id no.1所示：9.如权利要求6所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟强弱毒株鉴别诊断方法，其特征在于，cd2v-crrna的序列如seq id no.2所示：10.如权利要求6所述的运用crispr技术结合gfet对非洲猪瘟强弱毒株鉴别诊断方法，其特征在于，mgf-crrna的序列如seq id no.2所示：技术总结本发明属于生物技术、分子诊断与病毒检测领域，涉及运用CRISPR技术结合石墨烯场效应晶体管对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断，用于与Cas12a进行ASFV检测。对gFET表面进行疏水化处理，提高了gFET的稳定性，报告探针通过PBASE结合在gFET表面，造成gFET表面发生迪拉克点位移现象。设计一段crRNA特异性结合待检测目标片段与Cas12a蛋白形成复合体，激活Cas12a的切割活性，对体系内的DNA进行普遍性的切割，将crRNA，Cas12a和目标片段加入结合了探针的gFET上一起孵育1h，迪拉克点发生往回移动现象，表明待检测样本为阳性样本，目标DNA使Cas12a发挥活性，将gFET表面的探针DNA部分切除。该方法最低检测浓度达到0.5aM，并且可以对非洲猪瘟强弱毒株进行鉴别诊断。技术研发人员：陈蕾,王华,周圆,孙扬,盛辰,孙文博受保护的技术使用者：山东师范大学技术研发日：技术公布日：2024/1/11