云南地不容、千金藤和金线吊乌龟去甲乌药碱合酶筛选鉴定及应用

本发明属于植物基因工程，具体涉及三个千金藤属物种中主要活性成分千金藤素等bias生物合成途径中缩合多巴胺和4-hpaa生成去甲乌药碱的关键酶基因的筛选、鉴定及应用。

背景技术：

1、苄基异喹啉生物碱类(benzylisoquinoline alkaloids，bias)及其衍生物是含氮类生物碱，主要存在于毛茛目的毛茛科、小檗科、罂粟科和防己科，在其它植物如无患子目的芸香科(黄檗)、胡椒目的马兜铃科、樟目的樟科和番荔枝科、山龙眼目的莲科也有少量分布。bias大约有2500个不同结构的化合物，具有较高研究及药用价值，例如，来自于罂粟中的可待因、吗啡具有镇痛作用，罂粟碱具有抗凝血作用；来自黄连、黄柏等植物中的小檗碱、非洲防己碱具有抗菌作用；博落回主要活性物质白屈菜红碱、血根碱具有抗肿瘤、抗菌作用。

2、bias的生物合成途径始于l-酪氨酸，经酪氨酸转氨酶(tyrat)生成4-羟基苯丙酮酸后，经4-羟基苯丙酮酸脱羧酶(4hppdc)催化为4-羟基苯乙醛(4-hydroxyphenylacetaldehyde,4-hpaa)，或l-酪氨酸(l-tyrosine)经酪氨酸脱羧酶(tydc)成酪胺(tyramine)后，经多酚氧化酶(ppo)催化为多巴胺(dopamine)。多巴胺是异喹啉部分的前体，而4-hpaa则作为苄基的组成部分。4-hpaa和多巴胺在去甲乌药碱合酶((s)-norcoclaurine synthase，ncs)的催化下缩合形成去甲乌药碱。而后在甲基转移酶、细胞色素p450及bbe等多种酶作用下催化产生不同的bias。

3、ncs处于bias化合物合成的起始处，是bias类化合物生物合成的主要限速酶。千金藤的生物合成途径尚不明确，本研究旨在揭示防己科三个千金藤属物种云南地不容、千金藤和金线吊乌龟中主要活性成分千金藤素等bias的生物合成途径，寻找更多具有功能且可高效的缩合多巴胺和4-hpaa形成去甲乌药碱的ncs，为千金藤素等bias类化合物的体外合成及大规模应用奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供5个参与去甲乌药碱合成的三个千金藤属物种中去甲乌药碱合酶基因及其编码的蛋白质。

2、本发明的另一目的在于提供一种三个千金藤属物种中bias生物合成关键酶基因的筛选方法。本发明的第三个目的在于提供对上述筛选出的关键酶基因ncs的功能验证方法。

3、本发明提供的syncs4、syncs5、sjncs2、sjncs4和scncs1基因，其核苷酸序列为seqid no.1至seq id no.5所示，或其突变序列。

4、本发明提供的syncs4、syncs5、sjncs2、sjncs4和scncs1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.6至seq id no.10所示，或其突变序列。

5、本发明目的可通过如下技术方案实现，

6、技术方案一：基于基因组和转录组的三个千金藤属物种中bias生物合成关键酶基因筛选，步骤如下：

7、1)基于三个千金藤属物种的基因组，鉴定ncss基因家族成员，构建系统进化树分析防己科三个千金藤属物种与其他物种已报道ncss之间的进化关系，初筛三个千金藤属物种bias生物合成途径中缩合多巴胺和4-hpaa形成去甲乌药碱的关键酶蛋白序列。

8、2)基于三个千金藤属物种不同组织部位转录组数据，分析差异基因表达，进一步筛选bias生物合成途径中缩合多巴胺和4-hpaa形成去甲乌药碱的关键酶基因。

9、技术方案二：关键酶基因syncs4、syncs5、sjncs2、sjncs4和scncs1的功能验证。采用原核表达体系，以多巴胺和4-hpaa为底物，体外鉴定去甲乌药碱合酶syncs4、syncs5、sjncs2、sjncs4和scncs1的功能。

10、本发明公开了三个千金藤属物种中缩合多巴胺和4-hpaa形成去甲乌药碱的关键酶基因ncss的筛选及功能鉴定方法，验证syncs4、syncs5、sjncs2、sjncs4和scncs1具有缩合多巴胺和4-hpaa形成去甲乌药碱的功能，对阐明三个千金藤属物种中bias生物合成途径提供分子基础，同时具有重大的应用价值。

技术特征：

1.三个千金藤属物种中ncss基因，其特征在于其是如下的基因(a)或基因(b)：

2.三个千金藤属物种中ncs基因编码的蛋白质，其特征在于其是如下的蛋白质(a)或蛋白质(b)：

3.一种利用基因组和转录组数据筛选三个千金藤属物种中bias生物合成途径中缩合多巴胺和4-hpaa生成去甲乌药碱的ncss基因的方法，具体步骤如下：

4.三个千金藤属物种中ncss的体外酶活鉴定，具体步骤如下：

5.权利要求1编码三个千金藤属物种中bias生物合成途径中缩合多巴胺和4-hpaa生成去甲乌药碱的关键酶基因或其突变基因在植物基因工程中的应用。其特征在于三个千金藤属物种中syncs4、syncs5、sjncs2、sjncs4和scncs1在细菌、真菌和高等植物中通过基因工程手段合成bias的应用。

6.权利要求6所述的应用中，外源基因导入宿主细胞需要一种携带三个千金藤属物种中ncss编码基因的质粒，其特征在于：质粒可选自pet系列、pgex系列、pcold系列等原核表达载体，ppic9、phil-d2、ppic3.5等酵母表达载体及pbi系列、pcambia系列等植物表达载体，并含有权利要求1的核苷酸序列或突变序列。

技术总结
本发明涉及了防己科三个千金藤属物种云南地不容(Stephania yunnanensis)、千金藤(Stephania japonica)和金线吊乌龟(Stephania cephalantha)中缩合多巴胺和4羟基苯乙醛(4‑HPAA)生成去甲乌药碱的5个去甲乌药碱合酶NCSs(SyNCS4、SyNCS5、SjNCS2、SjNCS4和ScNCS1)及其编码基因与功能。属于基因工程技术领域。本发明公开了三个千金藤属物种5个NCS基因的开放阅读框序列以及其编码的氨基酸序列。本发明基于三个千金藤属物种基因组和转录组数据筛选候选NCS基因，通过构建pET28a‑NCSs原核表达载体，以多巴胺和4‑HPAA为底物在体外验证三个千金藤属物种NCS基因的功能。结果证明SyNCS4、SyNCS5、SjNCS2、SjNCS4和ScNCS1具有缩合多巴胺和4‑HPAA生成去甲乌药碱的功能，为具有重要药用价值的苄基异喹啉类生物碱BIAs的合成生物学研究奠定基础。

技术研发人员：徐志超,田亚,陈士林
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15