一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成NMN的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和生物工程领域，特别涉及一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成nmn的应用。

背景技术：

1、nad+是维持生物体生命活动的重要生物大分子，研究发现，nad+水平会随着年龄的增长出现系统性下降，通过补充烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，nmn)，可有效恢复nad+水平，改善代谢性疾病、衰老和神经退行性病变等相关疾病的病理状态，具有延缓衰老、延长寿命等功效。这些治疗功效促使开发含有nmn活性成分的功能性食品、保健品和药物具有广阔的应用前景。随着人们对nmn的药用和保健效果的认知在不断增加，市场上对nmn的需求量与日俱增。

2、而目前生产nmn的方法主要是酶催化法，其中之一是用烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase,nrk，ec 2.7.1.22)特异性催化烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，nr)和atp转化为nmn和adp。但是由于现有的烟酰胺核糖激酶的酶活性较低，将其应用于工业化催化生产nmn时，产率较低，导致生产成本较高，产品缺乏市场竞争力，严重制约了nmn的生物催化技术的工业化应用。因此，提高烟酰胺核糖激酶的催化活力是降低nmn的生物催化成本、提高烟酰胺核糖激酶的工业应用价值、促进生物催化技术在nmn工业化生产中应用的关键因素。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成nmn的应用，以解决现有技术中烟酰胺核糖激酶的活性较低、工业应用价值较低的技术问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种烟酰胺核糖激酶突变体。该烟酰胺核糖激酶突变体为seq id no:2所示的氨基酸序列的突变序列，突变位点至少包括如下位点之一：第34位、第6位或第47位；或者，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列为至少包括上述突变位点之一且与seq id no:2具有80％以上同一性、具有烟酰胺核糖激酶催化活性的氨基酸序列。

3、进一步地，突变位点为i6v、s34h或t47v。

4、进一步地，突变位点为i6v、s34h和t47v。

5、根据本发明的另一个方面，提供一种dna分子。该dna分子编码上述任一种烟酰胺核糖激酶突变体。

6、根据本发明的再一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒连接有上述dna分子。

7、进一步地，重组质粒的载体质粒为pbr327、pat153、puc18、puc19、pet21或petite；优选为petite。

8、根据本发明的又一方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述重组质粒。

9、进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为bl21(de3)大肠杆菌；优选真核细胞为酵母细胞或毕赤巴斯德酵母细胞。

10、根据本发明的再一方面，提供一种生产烟酰胺单核苷酸的方法。该方法包括采用烟酰胺核糖激酶对烟酰胺核糖和atp、或能够转化成烟酰胺核糖或者atp的前体物质进行催化反应，烟酰胺核糖激酶为上述任一种烟酰胺核糖激酶突变体。

11、进一步地，催化反应包括：以烟酰胺核糖和atp为原料，在烟酰胺核糖激酶突变体的催化作用下制备nmn；或者，以烟酰胺、磷酸核糖焦磷酸和atp为原料，在以烟酰胺核糖激酶突变体和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化用下制备nmn；或者，以烟酰胺、amp和焦磷酸或其盐为原料，以烟酰胺核糖激酶突变体和腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下制备nmn；优选的，烟酰胺核糖激酶突变体的使用形式为酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞；优选的，催化反应的温度为36～37℃；优选的，催化反应的ph为7.0～8.0℃；优选的，催化反应底物烟酰胺核糖的浓度为5～60mm。

12、应用本发明的技术方案，该突变体可高效催化烟酰胺核糖和atp转化为nmn，极大地降低了工业上应用生物催化技术生产nmn的成本，具有较高的工业应用价值。

技术特征：

1.一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶突变体为seqid no:2所示的氨基酸序列的突变序列，突变位点至少包括如下位点之一：第34位、第6位、或第47位；或者，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列为至少包括上述突变位点之一且与seq id no:2具有80％以上同一性、具有烟酰胺核糖激酶催化活性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述突变位点为i6v、s34h或t47v。

3.根据权利要求2所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述突变位点为i6v、s34h和t47v。

4.一种dna分子，其特征在于，所述dna分子编码权利要求1至3中任一项所述的烟酰胺核糖激酶突变体。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求4所述的dna分子。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体质粒为pbr327、pat153、puc18、puc19、pet21或petite；优选为petite。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选所述原核细胞为bl21(de3)大肠杆菌；优选所述真核细胞为酵母细胞或毕赤巴斯德酵母细胞。

9.一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，包括采用烟酰胺核糖激酶对烟酰胺核糖和atp、或能够转化成烟酰胺核糖或者atp的前体物质进行催化反应，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶为如权利要求1至3中任一项所述的烟酰胺核糖激酶突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化反应包括：以烟酰胺核糖和atp为原料，在所述烟酰胺核糖激酶突变体的催化作用下制备nmn；

技术总结
本发明公开了一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成NMN的应用。该烟酰胺核糖激酶突变体为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变序列，突变位点至少包括如下位点之一：第6位、第34位或第47位；或者，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列为至少包括上述突变位点之一且与SEQ ID NO:2具有80％以上同一性、具有烟酰胺核糖激酶催化活性的氨基酸序列。应用本发明的技术方案，该突变体可高效催化烟酰胺核糖和ATP转化为NMN，极大地降低了工业上应用生物催化技术生产NMN的成本，具有较高的工业应用价值。

技术研发人员：李巧峰,吕久安,童卫民
受保护的技术使用者：北京红惠新医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12